寡核苷酸药物生物分析策略：一文读懂如何选择前处理方式

寡核苷酸治疗药物，包括反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）和RNA干扰（RNAi），通过诱导酶依赖性降解和/或抑制目标mRNA，从而下调基因表达，突破传统药物的治疗局限。该类药物凭借多靶点、高靶向性、研发周期短和作用时间长等优势，已成为应对难治性疾病的新型治疗策略，近年来掀起了全球研发热潮^[1,2]。

本文聚焦LC-MS/MS生物分析平台，系统阐述二胺吗啉代寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers，PMO）、ASO、小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）三类寡核苷酸药物的常用样品前处理策略。通过解析不同方法的原理特征、技术优势及适用范围，结合案例分析，为寡核苷酸药物分析体系的优化提供科学参考。

LC-MS/MS分析寡核苷酸面临的挑战

为支持寡核苷酸药物的药代动力学和毒代动力学研究，需要采用经过验证的高通量生物分析方法，准确且灵敏地定量生物样本（如血浆、排泄和组织样本）中的寡核苷酸及其代谢物。常见的生物分析方法主要分为基于色谱联合检测平台的LC-MS/MS分析方法和通过探针来识别、捕获和检测寡核苷酸分子的杂交-ELISA、杂交-ECL、LC-荧光和qPCR等的分析方法^[2]。核酸杂交方法存在特异性差、难以区分n-1、n-2等代谢物、方法开发周期较长等局限，而LC-MS/MS技术凭借优越的特异性、精密度及较宽的定量范围，已成为临床前研究定量分析的首选方案。然而，复杂生物基质中的内源性干扰物质可能会影响寡核苷酸药物的定量准确性，而且寡核苷酸药物带有阴离子电荷，易与基质蛋白、细胞膜等发生非特异性吸附，导致常规蛋白沉淀法难以实现有效提取。因此，开发高特异性的样品前处理方法，成为提升寡核苷酸药物定量分析效能的关键突破口。

不同前处理方式选择

基于磷酸骨架修饰特性差异，寡核苷酸药物可分为：

• 电负性型（如ASO、siRNA等）；

• 电中性型（如PMO、peptide-PMO等）；

电中性寡核苷酸药物通常可以通过直接沉淀蛋白法（PPT）实现有效提取，而电负性寡核苷酸药物受电荷特性影响，需采用液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、酶解法（Proteinase K digestion）或合并LLE或者SPE、核酸杂交等方法进行提取^[3,4]。以下将对几种常用的前处理方式分别进行介绍。

蛋白沉淀 （PPT）

原理机制：通过加入水溶性有机溶剂（甲醇、乙醇等），使生物基质中具有表面水层的蛋白质脱水、相互聚集并析出。同时促使待测物从蛋白中解离并转移至有机溶剂中。

优势：操作便捷、成本可控、易于实施。

适用范围：适用于电中性PMO类药物，其分子表面电荷中性特征可有效规避非特异性吸附。

实证案例

以Viltolarsen为例，经甲醇沉淀处理后，大鼠血浆样本回收率达70%，LLOQ达2 ng/mL（详见图1）。

图1. 2 ng/mL Viltolarsen的大鼠血浆样品

液液萃取（LLE）

原理机制：基于相似相溶原理，加入与水不互溶的苯酚、氯仿及异戊醇混合有机溶剂，将寡核苷酸药物从蛋白中解离并转移至水层中。其中苯酚与蛋白结合促使蛋白质变性，脱离蛋白和目标物，寡核苷酸药物进入水相。氯仿加速相分离并去除痕量酚，加入少量异戊醇抑制萃取过程泡沫生成（原理详见图2）。

图2. 液液萃取示意图

技术优势：操作流程标准化、提取回收率稳定（>60%）。

适用范围：适用于亲水性电负性药物（siRNA及ASO）。

局限性：因其它与水互溶的内源性物质（盐、脂质、核酸、肽等）被提取，从而带来内源性物质，影响待测物分离，引起离子抑制或增强（基质效应）、基线噪音高、不同基质间提取回收率差异大等问题。从经验上来看，LLE方法用于血浆样本有较高回收率，用于组织匀浆和排泄样本（尿液、胆汁、粪便）可能存在基线噪音高，不同基质间回收率差异大等问题。

案例

通过LLE提取Nusinersen血浆样本，进行提取，LLOQ可以达2 ng/mL, 回收率＞90%（图3）。

图3. 2 ng/mL Nusinersen的大鼠血浆样品

在大鼠血浆和胆汁中测定Inclisiran时，AS链在不同的基质有明显信号差异。在胆汁中出现基质抑制现象，10 ng/mL大鼠血浆样品（保留时间3.82 分钟）与胆汁样品的峰高差异达7倍（图4-1与4-2对比）。

图4-1. 10 ng/mL Inclisiran-AS的大鼠血浆样品

图4-2. 10 ng/mL Inclisiran-AS的大鼠胆汁样品

测定Volanesoren的大鼠组织样本时，不同基质间有明显提取回收差异。20 ng/mL大鼠心脏匀浆样品（保留时间4.51分钟）与肝脏匀浆样品的峰高差异达4倍（图5-1与5-2对比）。

图5-1. 20 ng/mL Volanesoren的大鼠心脏匀浆样品

图5-2. 20 ng/mL Volanesoren的大鼠肝脏匀浆样品

固相萃取（SPE）

原理机制：通过以下两种作用，将待测物吸附到固定相材料上，通过清洗除去未被吸附的物质，再将目标待测物洗脱下来的过程（原理图如图6）。当待测物与基质中的蛋白作用力较强、难以提取时，还可以通过酶解合并SPE的方式进行。

• 亲水亲脂作用

待测样本中加入离子对试剂，与待测物进行离子配对，形成弱中性分子，结合到萃取小柱上，例如HLB小柱；

• 离子交换作用

待测样本中加入缓冲盐，使待测物解离呈阴离子状态，结合到萃取小柱上，例如WAX小柱。

图6. 固相萃取示意图

技术优势：样本获得净化并得以浓缩，有效消除基质干扰，不同基质间回收率差异小、基质效应弱。

适用范围：适用于大部分在碱性条件下稳定的寡核苷酸药物和生物基质，尤其是在不同组织匀浆、排泄基质间的基质效应差异大和回收率较差的寡核苷酸药物。

案例

以Inclisiran为例，当采用LLE提取大鼠胆汁样品中的Inclisiran AS链时，10 ng/mL的 Inclisiran AS链信号低（保留时间3.83分钟），且在3.73分钟有明显干扰峰。当更改前处理为SPE后，灵敏度提升10倍，干扰峰完全消除（图7-1与7-2对比）。

图7-1. LLE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的胆汁样品

图7-2.  SPE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的胆汁样品

核酸杂交

LC-MS/MS方法具有高特异性、快速方法开发以及同时定量寡核苷酸分析物及其代谢物的能力，但灵敏度相对较低，且无法区别结构类似物的干扰。为了提高灵敏度和提取的特异性，近年来开发了杂交LC-MS/MS方法，利用捕获探针（例如与寡核苷酸分析物互补的DNA链）实现目标寡核苷酸的高特异性和高效提取。相比传统的固相萃取（SPE）或液液萃取（LLE），其灵敏度获得显著提高（<1 ng/mL）。

核酸杂交工作原理如图8所示，根据待测物碱基序列，设计相应的DNA或PNA探针；将含有生物素的探针与连有链霉亲和素磁珠进行孵育结合；加入至生物基质中，通过碱基互补配对方式，将目标分析物链接到磁珠上；弃去废液，清洗磁珠，最后再经过高温变性的手段从探针上解离目标分析物，进而达到对目标分析物的提取和纯化^[5]。

图8. 核酸分子杂交示意图^[5]

优势：灵敏度高，选择性好；

适用范围：大部分寡核苷酸药物；

因目标分析物从探针上解离出来受杂交复合物Tm值的影响，较长的探针对应的Tm较高，高温变性会导致与磁珠结合的探针也一并从磁珠上解离，在色谱分离过程中，形成的杂交复合物在低柱温下难以解离，而高柱温时会影响色谱柱寿命；较短探针具有较低的Tm，但会影响杂交效率。因此探针的最佳长度需要通过实验确定。

结 语

当前LC-MS/MS检测寡核苷酸药物的前处理方式种类繁多，为发挥最大优势，在实际应用中可根据试验场景及检测要求进行策略组合。药明康德DMPK在寡核苷酸前处理方法上具备丰富经验，通过建立成熟的平台技术体系，可针对性提供从方法开发到数据报告的全周期解决方案，以最大化满足客户对不同试验的个性化需求。

作者：何理想，安培云，卢金莲，邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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