抗体偶联药物（ADC）常用有效载荷药代动力学性质总结

抗体偶联药物（ADC）的有效载荷分为DNA烷化剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白破坏剂和RNApolII抑制剂等，除了以肿瘤为适应症的有效载荷，其他作用机制的有效载荷如糖皮质激素等不断出现，使得ADC的适应症由肿瘤扩展到抗炎和自身免疫性疾病等领域。目前上市的ADC的有效载荷数量有限，临床阶段的有效载荷主要包括MMAE、DM1、SN-38、DXd及其衍生物和PBD等，下面我们重点总结了常用的ADC有效载荷的药代动力学特征，包括分布、代谢、排泄、体内PK、药物相互作用等。

澳瑞他汀衍生物MMAE和MMAF的药代动力学特征

MMAE (Monomethyl auristatin E)

MMAE是一种高效细胞毒素，可与微管结合，通过抑制细胞分裂导致细胞周期停滞并引起细胞凋亡。MMAE具有高渗透性，有很强的旁观者效应^[1]。

[³H]-MMAE在ICR小鼠、Wistar大鼠、食蟹猴和人血浆蛋白结合率分别为18.8%-28.5%、72.0-73.5%、17.1-18.9%和67.9%-82.2%（表1），血浆蛋白结合率呈现种属依赖性。在1-100 nmol/L浓度下，[³H]-MMAE的大鼠和猴血浆蛋白结合率不随浓度的改变而改变，但小鼠和人血浆蛋白结合率不同浓度下差异明显。体外试验表明MMAE的人全血血浆分配比为0.79-0.98^[2]。

表1. MMAE的小鼠、大鼠、猴和人血浆蛋白结合率^[3]

接种了MDA-MB-468乳腺癌细胞的荷瘤小鼠在静脉给药0.1 mg/kg的MMAE后，MMAE浓度在血浆中迅速下降，给药5 min后血浆中仅剩注射剂量的0.3%，12 h后血药浓度低于定量下限(0.2 ng/mL)。MMAE的血浆AUC_0-12h为54.3ng·h/mL，AUC_0-last为54.5 ng·h/mL，系统清除率CL为60 mL/h，血浆末端清除半衰期为2.5 h，稳态分布体积Vd_ss为42 mL。与血浆相比，MMAE在组织中浓度下降较缓，在肿瘤中能维持较稳定的水平，至给药后168 h组织中浓度降低了50%，MMAE集中分布在肝脏^[4]。

静脉注射0.06 mg/kg的[³H]-MMAE后，雄性和雌性Sprague Dawley (SD)大鼠全血和血浆中放射性活度随时间变化曲线见图1^[3]。

图1. 静脉注射0.06mg/kg的[³H]-MMAE后，雄性（左）和雌性（右）SD大鼠全血和血浆中放射性活度随时间变化曲线

MMAE的代谢主要由CYP3A4介导，CYP2D6可能也参与其中。在体外大鼠、猴、人肝细胞中，以及人临床样品中共检测到13种代谢物，推测结构式以及代谢途径如图2所示。基于体内外试验，MMAE在人体内主要发生脱甲基、脱氢、酰胺水解和氧化代谢。MMAE在大鼠、猴和人肝细胞中孵育240分钟后，共检测到12个代谢产物。这12种代谢产物在猴种属中均能检出，有9种代谢产物在人种属中检出。3个种属中M4（O-脱甲基产物）和M6（羟化产物）信号较强，提示为主要代谢物。人种属中未检测到特有的代谢物。体外细胞毒性结果表明M7和M4的细胞毒性远小于MMAE，而M8的细胞毒性与MMAE较为接近，即细胞毒性M7<<M4<M8≈MMAE。

图2. 体外和人临床样本中鉴定的MMAE代谢物汇总^[3]

大鼠体内排泄试验表明，MMAE可通过胆汁分泌，主要通过粪便排泄，有一部分可通过尿液排出。在单次静脉注射[³H]-MMAE后，在大鼠粪便中检测到97%（雄性）和102%（雌性）的放射性物质，在大鼠尿液中检测到15%（雄性）和9%（雌性）的放射性物质。在大鼠尿液和粪便中的放射性物质大部分为原型[³H]-MMAE，粪便中可检测到一个较小峰，鉴定为代谢物M4（O-脱甲基产物）。在给药后48小时，约90-95%的[³H]-MMAE排出体外，[³H]-MMAE在大鼠体内的半衰期为1-2.3天。在给药28天后，大鼠尸体中未检测到放射性，提示MMAE和其代谢物已完全排出体外^[5]。

MMAE不诱导CYP450酶，MMAE对CYP3A（以咪达唑仑为底物）（后续以“CYP3A-M”表示）的抑制IC₅₀为10 µM，对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A（以睾酮为底物））（后续以“CYP3A-T”表示）无直接抑制作用，IC₅₀大于100 µM。MMAE是CYP3A-M和CYP3A-T的时间依赖性抑制剂，K_inact为0.1 min-1（即每分钟约有10%的CYP3A失活），MMAE达半数最大失活的浓度（K_I）是1.12 µM ^[3]。在体外MDCK细胞和MDCK-MDR1细胞试验中表明MMAE是P-糖蛋白（P-gp）的底物，但MMAE不是乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、多药耐药相关蛋白2（MRP2）、有机阳离子转运体2（OCT2）、有机阴离子转运体1和3（OAT1、OAT3）、有机阴离子转运多肽1和3（OATP1B1、OATP1B3）的底物。在临床相关浓度下，MMAE不是P-gp、BCRP、BSEP、MRP2、OCT1、OCT2、OAT1、OAT3、OATP1B1和OATP1B3的抑制剂^[5]。

MMAF (Monomethylauristatin F) ^[6]

MMAF可以抑制微管蛋白，破坏微管网络，导致肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡。MMAF的C末端羧基可以与微管蛋白的氨基酸形成更多氢键作用，因此对微管蛋白结合能力优于MMAE，但由于MMAF膜通透性较差，因此作为ADC的有效载荷往往不能发挥旁观者效应。Blenrep使用了不可裂解连接子连接MMAF，释放出的带有连接子的游离细胞毒药物Cys-mcMMAF（结构见图3）。

图3. MMAF和cys-mcMMAF的结构

Cys-mcMMAF在人血浆中呈浓度依赖性低蛋白结合，0.5 ng/mL时未结合百分比为49.1-61.8%，5 ng/mL时为68.8-70.7%，50 ng/mL时为80.9-88.7%。

在体外试验中，线性cys-mcMMAF主要通过水解脱水形成环状cys-mcMMAF，该过程不依赖于NADPH或UDPGA。

³H-cys-mcMMAF与大鼠、猴和人的肝脏S9组分孵育后，代谢过程以非酶催化为主，发生少量氧化和II相代谢。

大鼠单次静脉注射10 mg/kg的³H-cys-mcMMAF后，大部分放射性剂量随粪便排出(约83%)，尿排泄(约13%)是次要排泄途径。放射性物质排出迅速，在给药后48小时回收到94%的放射性给药剂量。在给药7天内的放射性总回收率为96%。尿液中的主要成分是线性cys-mcMMAF，所有其他确证的代谢物均占放射性剂量的1%以下。粪便中的主要成分是环状cys-mcMMAF，所有其他确证的代谢物各占放射性剂量的5%以下。

体外试验表明，cys-mcMMAF不是CYP450酶的抑制剂或诱导剂。Cys-mcMMAF是OATP1B1、OATP1B3、MRP1、MRP2、MRP3和胆盐输出泵（BSEP）的底物，可能是P-gp的底物。

美登素衍生物DM1和DM4的药代动力学特征

美登素是一种安莎霉素类的大环内酯，DM1和DM4均为美登素的衍生物（结构见图4)。DM1和DM4可抑制微管蛋白聚合和微管组装，导致细胞周期阻滞和细胞凋亡^[7]。

DM1

DM1在大鼠血浆中结合率为97.1%，在食蟹猴和人血浆中结合率分别为91.5%和92.5%，且结合率在20-1000 ng/mL范围内均并未呈现出明显的浓度依赖性^[8]。

肝微粒体的酶表型鉴定结果显示，DM1在肝微粒体中的代谢主要依赖于NADPH，CYP3A4或CYP3A5是参与DM1代谢的主要代谢酶。 

人CYP450重组酶的酶表型鉴定结果基本与肝微粒体的酶表型鉴定结果匹配，CYP3A4和3A5是参与DM1代谢的主要代谢酶，CYP2C9和2E1对DM1的代谢起较小作用。其他同工酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6和CYP4A11）在DM1代谢消除的过程中起很少作用或者不起作用。

在酶表型鉴定实验中鉴定得到几个代谢物M2、M3和M7（结构见图4）。其中磺化代谢物M3和M2的水溶性显著高于DM1，因此更容易在尿液中被排出。而代谢物M7与DM1相比水溶性差，毒性可能更强。

图4. DM1/DM4的结构及DM1的3个代谢物可能结构^[8]

DM1在0.1、1、10、100、500和1000 nM浓度下对CYP1A2、2B6和3A4/5无诱导潜力。在NADPH生成体系中，678 nM的DM1对CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A的活性抑制率不足50%，即DM1在测试浓度下不会引起可逆性抑制。但DM1与人肝微粒体预孵育30分钟后，对CYP3A-M有时间依赖性抑制的潜力，其IC₅₀为155 nM。

体外实验表明，DM1可能是P-gp的底物，未表现出对其他常见转运体的抑制潜力。

DM4

DM4和代谢物S-甲基-DM4（DM4-Me）在人血浆表现为超高结合率，结合率分别为99.38%和99.27%。在孵育60分钟后，DM4的全血血浆分配比随着孵育浓度的升高而降低。DM4-Me在大鼠和猴的全血血浆分配比随着浓度的升高而降低，但在人全血血浆分配比变化不大。DM4和DM4-Me的大鼠、猴和人全血血浆分配比见表2。

表2. DM1的大鼠、猴和人全血血浆分配比^[7]

DM4在人、大鼠、猴血浆中不稳定，但是在人、大鼠和猴子的全血中孵育90分钟稳定。其代谢物DM4-Me在人血浆中单独孵育或与DM4共孵育8小时均稳定，且DM4-Me在人、大鼠和猴子的全血中孵育90分钟稳定。

CYP3A4是参与DM4和DM4-Me代谢的主要CYP450酶。

食蟹猴单次静脉注射0.1 mg/kg的DM4，给药后0.5小时猴血浆中检测到~ 0.56 µg/mL的DM4，给药后7小时DM4在猴血浆中低于定量限（3.6 ng/mL）。DM4在猴血浆中半衰期为2小时。

DM4和DM4-Me对CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4无诱导风险。DM4和DM4-Me对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A无直接抑制作用。DM4对CYP3A表现出时间依赖性抑制，DM4-Me对CYP2C8和CYP2C9表现弱的时间依赖性抑制。

DM4和DM4-Me是P-gp的底物，不是P-gp的抑制剂。

拓扑异构酶抑制剂的药代动力学特征

SN-38^[9]

SN-38是拓扑异构酶I抑制剂伊立替康的活性代谢产物，SN-38与拓扑异构酶I相互作用，防止拓扑异构酶I诱导的单链断裂后的重新连接，损伤DNA，导致细胞凋亡和细胞死亡。

在生理pH下，SN-38的内酯环可以水解成羧酸盐形式，这个转换依赖于pH的改变（图5）。由于只有内酯形式具有抗肿瘤活性，所以pH的微小变化会影响SN-38的药代动力学和药效。在50-200 ng/mL浓度范围内，SN-38在人血浆中蛋白结合率为94-96%。在血浆中SN-38的内酯形式占主导地位，大部分SN-38与白蛋白结合，白蛋白也稳定了SN-38的内酯形式。SN-38在10、50、200 ng/mL浓度下的全血血浆分配比分别为1.46、1.24和1.23 ^[10]。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)可介导SN-38的葡萄糖醛酸化，形成无活性的葡萄糖醛酸代谢物SN-38G，并通过胆汁排泄。几种UGT亚型如肝脏中的UGT1A1、UGT1A9和肝外的UGT1A1、UGT1A7、UGT1A10参与了转化，其中UGT1A1、UGT1A7和UGT1A9是主要同工酶。

肠道细菌中含有的β-葡萄糖醛酸酶可降解SN-38G生成SN-38，从而使SN-38在肠道被重新吸收。

肾脏消除对SN-38的排泄贡献较小^[11]。

SN-38是OATP1B1的底物。

图5. pH介导的SN-38内酯和开环形式的相互转化^[9]

DXd

DXd是依喜替康的衍生物，可以与拓扑异构酶I-DNA可裂解复合物结合，从而诱导双链DNA断裂，最终导致癌细胞凋亡。DXd具有与依喜替康类似的TOP1抑制作用，并且克服了传统微管蛋白结合药物如紫杉醇的耐药性，具有很强的旁观者效应^[1]，且骨髓毒性更低。

DXd的小鼠、大鼠、猴和人血浆蛋白结合率见表3，表现为中等到高的结合率。DXd的人全血血浆分配比为0.6。

表3. DXd的小鼠、大鼠、猴和人血浆蛋白结合率（n=3）^[12]

食蟹猴静脉注射1mg/kg的DXd后，DXd迅速从体内清除，清除率为2390±499 mL/h/kg,血浆末端消除半衰期为1.37±0.766 h，药代动力学参数见表4^[12]。

表4. 猴静脉给药DXd后的PK参数(N=3，平均值±标准偏差)

DXd的排泄途径主要是粪便。胆管插管的大鼠静脉给药1mg/kg的[¹⁴C]DXd，给药24小时后在胆汁、尿液和粪便中分别发现71.5%、19.8%和1.0%的放射性物质，合计收集到92.3%放射性物质。胆汁中的放射性物质大部分为原型[¹⁴C]DXd^[13]。

体外实验表明CYP3A4可介导DXd的代谢。体外实验中，DXd不抑制CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A，不诱导CYP1A2、CYP2B6或CYP3A4。体外实验中，DXd是OATP1B1、OATP1B3、多药及毒素外排转运蛋白2-K（MATE2-K）、P-gp、MRP1和BCRP的底物。在临床相关浓度(稳态C_max~0.2 μmol/L)下，DXd对OAT1(IC₅₀值为12.7 μmol/L)、OAT3、OCT1、OCT2、OATP1B1(IC₅₀值为14.4 μmol/L)、OATP1B3、多药及毒素外排转运蛋白1（MATE1）、MATE2-K、P-gp、BCRP或BSEP转运体具有较低的抑制潜力^[12]。

从临床前药代数据看，DXd如果单独成药，其成药性并不好，如食蟹猴体内清除率过高。但设计成ADC后，却成了一个优势，能有效降低有效载荷的系统毒性。

DNA烷化剂PBD的药代动力学特征

PBD（pyrrolobenzodiazepine）通过与DNA小沟中的鸟嘌呤结合形成一个共价键，抑制核酸合成和细胞分裂产生细胞毒性。PBD的二聚体形式与DNA的作用面积更大，可与鸟嘌呤形成两个共价键将DNA固定的更加牢固，形成高度细胞毒性的DNA链间交联并导致细胞死亡，对多种肿瘤细胞的有效抑制浓度可达皮摩尔级别。鉴于此，PBD逐渐被用作新型ADC的有效载荷，成为地位仅次于澳瑞他汀类毒素和美登素后的第三个新兴毒素。

PBD二聚体的人血浆蛋白结合率约为94%。

大鼠静脉给药[³H]-PBD二聚体后，总放射性物质主要通过粪便和胆道排出(97.5±3.0%)，少量通过尿液排出(3.8±0.3%)。

临床相关的游离PBD二聚体浓度下，PBD二聚体不抑制CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A。PBD二聚体是CYP3A4/5的底物，但不是其他主要CYP酶的底物。推测在血清中，临床相关的游离浓度下，PBD二聚体介导的CYP诱导的潜力很低。PBD二聚体是P-gp的底物，不是BCRP、OATP1B1和OCT1的底物。临床相关的游离PBD二聚体浓度下，PBD二聚体不抑制P-gp、BCRP、OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、OCT1、MATE1、MATE2‐K和BSEP^[14]。

软海绵素类艾瑞布林的药代动力学特征

艾瑞布林（Eribulin）是一种微管蛋白抑制剂，导致G2 / M细胞周期阻滞，有丝分裂纺锤体破裂，并最终导致有丝分裂过程终止和细胞死亡。

在100 ng/mL到1000 ng/mL浓度范围下，艾瑞布林的人血浆蛋白结合率为49%-65%。

艾瑞布林在人体内没有主要代谢物。CYP3A4在体外对艾瑞布林的代谢可忽略不计。给药¹⁴C-艾瑞布林后，人体血浆中主要循环物质为艾瑞布林，代谢物浓度小于母体浓度的0.6%。

艾瑞布林主要通过粪便以原型排泄。在给予¹⁴C-艾瑞布林后，约82%通过粪便排泄，约9%通过尿液排泄。原型成分在粪便和尿液中约占剂量的88%和91%。

在人肝微粒体中艾瑞布林抑制CYP3A活性，但艾瑞布林不太可能显著增加血浆中CYP3A底物的水平。当浓度达到5 μM时，对人肝微粒体中CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP2E1均无明显抑制作用。在原代人肝细胞中艾瑞布林对CYP1A、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4无诱导潜能。临床相关浓度下，艾瑞布林可能抑制P-gp，但不抑制BCRP、OATP1B1、OCT1、OAT1、OAT3和MATE1。体外研究表明艾瑞布林是P-gp的底物，而不是BCRP、MRP2、MRP4、BSEP、OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT1、OCT2和MATE1的底物^[15]。

表5. 8个有效载荷药代动力学特征汇总

常见有效载荷药代动力学特征汇总见表5。ADC给药后体内血浆中有效载荷的浓度较低的情况下可采用放射性标记的有效载荷进行血浆蛋白结合率的研究。有效载荷代谢酶表型鉴定非常重要，为后续可能的DDI风险、毒性反应和临床联合给药设计提供参考。推荐使用放射性标记的有效载荷进行排泄/物料平衡研究，能保证较高的回收率，并明确有效载荷的排泄途径，如MMAE、Cys-mcMMAF、DXd、PBD和艾瑞布林均采用放射性标记的有效载荷开展。有效载荷与转运体的相互作用，影响药物在体内的分布和排泄，进行外排转运体底物的评价很有必要。关于ADC有效载荷更详细的药代动力学研究策略欢迎阅读：ADC有效载荷（Payload）的发展及其药代动力学考量。

总结与展望

本文就ADC常用有效载荷及其药代动力学特征做了总结，随着ADC飞速发展，传统的有效载荷的临床局限性如疗效不足和获得性耐药等限制了ADC的发展，开发新的高效低毒且耐药性低的有效载荷迫在眉睫，因此催生了其他的新型ADC有效载荷。将抗体与光敏剂偶联，使用光应用系统激活以杀死肿瘤；将抗体与放射性核素偶联，以控制核素在特定部位发挥作用；将抗体与siRNA偶联，克服寡核苷酸递送障碍。前药也是一种兴起的有效载荷，将有效载荷设计成前药，利用其进入肿瘤细胞后才被激活和释放的特性，可进一步提高ADC的特异性和治疗窗口。除了优化单一的有效载荷外，开发携带两个具有不同或相似作用机制的有效载荷不失为一种新策略。这些双载荷药物在获得更佳药效的同时可以在一定程度上解决耐药和抗原表达异质性的问题^[16]。这些新型的有效载荷正在以独特的优势催生下一代ADC。

作者：陈冲，程起干，马利萍，金晶

编辑：钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。

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