2022年7月CDE发布了《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则》征求意见稿，建议根据抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）的具体情况，有针对性地设计非临床阶段的药理学、安全药理学、药代动力学、毒理学试验。尤其对于某些ADC，尽管荷载的小分子化合物（Payload）为已上市药物，仍需要关注由于裂解、切割方式的不同生成新的游离小分子化合物的情况，需按照新化合物所遵循的原则开展血浆蛋白结合率、组织分布、代谢、排泄/物质平衡、药物代谢酶及转运体影响研究。

由于小分子化合物的体循环暴露可能很低，受基质干扰也较为严重，且不可裂解型ADC的裂解产物很难预测，因此ADC的组织分布、体内代谢和排泄检测存在诸多挑战，指导原则建议拟靶向特定组织病灶的ADC，需要进行组织分布研究，可以通过放射标记小分子化合物来评价，也可以分别放射标记抗体和小分子化合物获得更为全面的组织分布特征。

本篇文章主要总结了目前ADC药物标记放射性核素的方法，并举例介绍在发现和开发阶段，如何筛选出DAR值最佳的ADC药物；在申报阶段，如何应用放射性示踪技术全面阐述ADC药物的体内特征。

一、ADC药物的放射性核素标记方法

在开展放射性实验前，首先选择合适种类的放射性核素进行标记合成，小分子化合物和抗体需各自采用不同的核素。

小分子化合物通常采用低能量放射性核素¹⁴C或³H来标记，这两种核素的比活度分别为~62.4 mCi/mmol（¹⁴C）和~28.6 Ci/mmol（³H）。因大多数ADC药物的小分子化合物体内浓度低，样品检测困难，建议尽量提高放射性给药剂量以满足检测需求。

放射性给药剂量（µCi/kg）=化学剂量（mg/kg）×比活度（µCi/mg）

通常ADC的DAR值越高，单个小分子上可标记的核素个数越多，合成得到的比活度就越大。³H标记的比活度明显高于¹⁴C，但考虑到³H标记在体内易发生氢氚交换，样品需要检测挥干前和挥干后双份，研究的难度和成本增加，所以在满足检测需求的前提下，更推荐选择¹⁴C标记小分子化合物。

抗体部分通常采用高能量的放射性核素¹²⁵I或⁸⁹Zr等标记。因其比活度较高，检测限不再成为限制因素，合成时考虑的因素包括：抗体含有的氨基酸种类（不同核素对应标记特定的氨基酸）；核素的衰变半衰期（建议不短于抗体在体内的生物半衰期）；标记后抗体的稳定性和活性等。其中¹²⁵I核素较易获得，标记过程简单温和，对抗体活性影响较少，是比较常见的选择。

各常用放射性核素的标记方法总结如下：

图1. 常用放射性核素的标记方法

*表示同位素的标记位置

目前已上市的ADC药物，如武田制药的Adcetris、Padcev，罗氏的Kadcyla、Polivy，辉瑞的Besponsa，阿斯利康的Enhertu、ADC Therapeutics的Zynlonta、Seagen/Genmab的Tivdak在临床前阶段均采用了低能量放射性核素（¹⁴C或³H）标记小分子化合物，完成了组织分布、物质平衡、血浆蛋白结合率、代谢产物鉴定等实验。其中Kadcyla、Polivy、Enhertu、Trodelvy、Tivdak同时采用了放射性核素（¹²⁵I、¹¹¹In、³H、⁸⁹Zr）标记抗体，对比仅标记抗体或小分子化合物后呈现出的组织分布差异。

二、发现和开发阶段筛选出DAR值最佳的ADC药物

在开发阶段，采用高灵敏度的放射性示踪技术，可以清楚的跟踪ADC在体内的药动学行为，通过分别标记裸抗体、ADC的抗体和小分子化合物，对比不同标记位置、不同偶联方式的体内行为差异，有助于尽早筛选出符合预期的ADC。

SAR3419是由CD19蛋白抗体（huB4）和微管抑制剂DM4（Maytansine简称May）组成的ADC药物。采用¹²⁵I单独标记裸抗体得到[¹²⁵I]Ab，标记ADC的抗体部分得到[¹²⁵I]Ab-L-May。分别给予小鼠[¹²⁵I]Ab或[^125I]Ab-L-May后，结果显示两者在小鼠体内的组织分布结果完全一致。提示DAR值在3.5-4范围内，huB4抗体偶联小分子化合物DM4（May）后，不会改变裸抗体在体内的组织分布^[2]。

图2. SAR3419的结构式^[2]

图3. 小鼠静脉注射给予[¹²⁵I]Ab或[¹²⁵I]Ab-L-May后的组织分布柱状图^[2]

如抗体相同，不同的DAR值是否会改变小分子化合物在体内的分布？下方展示的实验设计中，在合成[³H]小分子化合物后，分别制备可裂解（M9346A-sulfoSPDB-DM4）和不可裂解（J2898A-SMCC-DM1）的ADC，DAR值范围从低（平均~2，范围0-4）到非常高（平均~10，范围7-14）。在小鼠体内的药代动力学分析表明，DAR平均值在6以下的ADC，具有较好的药代动力学清除速率，DAR平均值在9以上的ADC，清除很快。组织分布结果显示DAR值较低的ADC组织分布特征与裸抗体相似，而DAR值超过9的ADC组织分布和裸抗体有明显差异：给药后小分子化合物在全血中的浓度迅速下降，同时很快积聚在肝脏，随后经肝脏快速排出体外，导致体内暴露量降低，对应药效学表现不佳^[3]。

图4. CD1小鼠分别静脉注射M9346A-sulfo-SPDB-[³H]DM4 (A)或J2898A-SMCC-[³H]DM1 (B)后的药动学研究^[3]

图5. CD1小鼠分别静脉注射M9346A-sulfo-SPDB-[³H]DM4 (A)或J2898A-SMCC-[³H]DM1 (B)后的组织分布研究^[3]

三、申报阶段，应用放射性示踪技术全面阐述ADC药物的体内特征

对于拟靶向特定组织病灶的ADC，需要进行组织分布研究，建议选用药效学动物模型开展，荷瘤鼠实验可参考前期的ADC系列文章：如何用全身放射性自显影技术（QWBA）研究抗体偶联药物在荷瘤小鼠的组织分布，采用QWBA方法不仅可以获得整个组织的平均浓度，而且可以区分组织内各区域的浓度差异，再分区域定量，尤其对于评估ADC药物在肿瘤组织的分布深度与药效之间的量效关系具有传统摘取法不可比拟的优势。

2019年上市的Trastuzumab deruxtecan（代号DS-8201a或T-DXd，商品名Enhertu）是HER2靶向抗体和DNA拓扑异构酶I抑制剂Dxd的结合物，用于治疗HER2阳性无法切除或转移性乳腺癌成人患者。根据公开文献整理其药代动力学研究内容如下。

图6. DS-8201a的结构式和放射性核素标记位置

为方便区分不同的标记位置，将ADC表示为Ab-L-Dxd（Ab：抗体；L：连接子；Dxd：小分子），分别采用³H标记ADC中的抗体表示为[³H]Ab-L-Dxd，¹⁴C标记ADC中的小分子化合物表示为Ab-L-[¹⁴C]Dxd，另外还采用¹⁴C单独标记了小分子即[¹⁴C]Dxd。

两组食蟹猴分别给予[³H]Ab-L-Dxd或Ab-L-[¹⁴C]Dxd，采用QWBA技术对比两者组织分布的差异，结果显示：两种不同标记位置的ADC在全血及重要组织器官中的分布特征相似，唯一的区别是Ab-L-[¹⁴C]Dxd在大肠中的分布很高，而[³H]Ab-L-Dxd在肠道中分布较低。Ab-L-[¹⁴C]Dxd的主要排泄途径为粪便（67.3%），次要排泄途径为尿液（18.7%），且粪便和尿液中未检测到除[¹⁴C]Dxd以外的其他代谢产物。为进一步证实游离小分子[¹⁴C]Dxd从ADC释放后的去向，增加了大鼠胆管插管实验，显示游离小分子[¹⁴C]Dxd有71.5%经胆汁排出。

结合上述两种动物的实验结果，完整阐述Ab-L-Dxd在体内的药动学过程：Ab-L-Dxd注射进入体内后，跟随抗体驱动分布至全身各处，全血中浓度最高，并不在正常组织中滞留，这一特点大大降低了安全性风险。在体内释放出Dxd后，Dxd基本不代谢，绝大部分以原形的形式经胆汁流入肠腔，最终再从粪便排出体外^[4]。

图7. 静脉注射给予食蟹猴的[³H]Ab-L-Dxd (a) (b)或Ab-L-[¹⁴C]Dxd (c) (d)后24小时(a) (c)和336h (b) (s)的代表性全身定量放射自显影图^[4]

图8. 静脉注射给予食蟹猴Ab-L-[¹⁴C]Dxd后0-336小时累积排泄百分率和静脉注射给予胆管插管大鼠[¹⁴C]Dxd后0-48小时累积排泄百分率^[4]

图9. 静脉注射给予食蟹猴Ab-L-[¹⁴C]Dxd后粪便和尿液中的放射性代谢物谱图

综合分析已上市ADC的药代动力学的申报资料和相关文献，结合《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则》征求意见稿，参考前期的ADC系列文章《研究抗体偶联药物（ADC）的小分子毒素释放和代谢的策略和方法》，推荐ADC化合物进行DMPK研究时首先开展体外实验，包括：肝S9中ADC释放的与小分子化合物有关的代谢产物鉴定；肿瘤细胞中ADC释放的与小分子化合物有关的代谢产物鉴定；ADC的血浆/血清稳定性研究。根据体外实验结果，可以初步判断ADC是否会释放新的游离小分子化合物。

在动物实验阶段，血浆浓度和组织分布结果对于ADC的药效和安全性评估至关重要，应检测ADC、总抗体、游离小分子浓度，建议采用放射性核素标记法追踪体内的组织分布行为，分别标记小分子化合物和抗体后，考察两者组织分布特征是否相似。如有个别组织区别较大，可借助游离小分子的体内行为推测具体原因。然后根据放射性血浆、尿液和粪便的代谢产物鉴定结果，进一步确认ADC在体内是否会生成新的游离小分子化合物。再遵循指导原则的要求，补充新生成的小分子化合物的血浆蛋白结合率、药物代谢酶及转运体影响研究。

结语

目前《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则》还处于征求意见阶段，药明康德DMPK将实时关注最新进展，紧跟最新的指导原则要求，不断追求更高标准，欢迎关注。

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作者：于雪、李欢、张玲玲

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟