同时测定总抗和结合型载荷：ADC药物LC-MS/MS分析策略

抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC) 是通过连接子将具有生物活性的小分子（载荷）连接到抗体药物上，抗体作为载体将小分子药物递送到目标细胞中的一种新型肿瘤药物。由于其明确的靶向性、递送治疗药物的有效性，ADC药物成为当前治疗肿瘤疾病的药物新方向，并在临床中得到了越来越多的应用。

ADC给药后在生物机体内会以多种形式存在，包括ADC、ADC生物转化产物、游离载荷、载荷-部分连接子及其相关代谢产物等。在体内药代动力学研究中，一般需要检测总抗体（Total antibody）、结合型抗体（Conjugated antibody）、游离载荷（Free payload）、药物-抗体比（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）、结合型载荷（Conjugated payload）、药物-连接子(Drug-linker)、相关代谢产物以及ADC的免疫原性等。在了解ADC对疾病的实际作用时，需要用到多种生物分析平台，常见的生物分析手段包括ELISA、LC-HRMS和LC-MS/MS等。目前主要受关注的是总抗体、结合型抗体、结合型载荷和游离药物在体内的变化。

近年来，由于液相色谱-质谱检测蛋白技术的发展，以及处理蛋白的酶优化，利用质谱平台检测生物样品中ADC总抗体和结合型载荷的能力得到迅猛的发展。本文以Enhertu（DS-8201）为例，总结了可以在一个样品中同时检测ADC药物的总抗体和结合型载荷的分析方法。

液相色谱-质谱平台检测ADC总抗体和结合型载荷

在体内样品的生物分析特别是模型小鼠等的实验中，样品量常常是非常有限的。因为ADC相关的生物分析往往同时涉及到小分子和大分子部分，同时可能需要检测免疫原性等，对样品量的需求更大。与此同时，在ADC大分子检测的样品前处理中，免疫捕获耗时长且试剂消耗大，是总抗体检测、结合型载荷检测所共用的步骤。如果这两个指标能够用同一份样品同时测定，可以减小样品需求量，同时减少样品前处理的总工作量，缩短分析时间。

液相色谱-质谱平台检测ADC总抗体时，通常需要在富集纯化抗体后酶解，再选取抗体的特征肽段进行定量，从而得到总抗体的浓度。液相色谱-质谱平台检测结合型载荷时，需根据载荷连接的设计原理，选用合适的解离方式，如酶解（例如胰酶、木瓜蛋白酶等）或通过调节pH，将载荷解离后进行检测。

为了获得较低的检测下限，需要从特征肽段的选择、ADC免疫富集、酶的选择、酶解条件、肽段和载荷的纯化以及液相色谱-质谱条件等方面进行优化。

案例分享

DS-8201是一款由抗HER2单克隆抗体通过基于四肽的可切割连接子，与拓扑异构酶I抑制剂连接的抗体偶联物，已被批准用于治疗转移性HER2阳性乳腺癌患者^[1]。即使在低水平表达的HER2的靶向部位，DS-8201也可以有效地将小分子载荷传递至癌细胞，从而很好地解决了上一代ADC的局限性。作为ADC药物代表，我们以DS-8201为例，提供了一种利用高效液相色谱-串联质谱在同一样品中同时检测总抗体和结合型载荷的分析方法开发。

DS-8201的样品前处理流程见图1。

图1. 待测基质中 DS-8201 的样本处理工作流程

图2. DS-8201分析物信息

具体操作流程如下：

质谱部分：前瞻性寻找特征肽和调谐MS

• 筛选小分子载荷Dxd的适用离子对。

• 筛选抗体部分的特征肽段，及其最优监测离子对。

1. 根据 DS-8201和内标蛋白的氨基酸序列， 用软件预测特征肽段和对应的离子对信息。

2. 将DS-8201和内标蛋白用胰蛋白酶酶解后，在质谱上筛选特征肽段和对应的离子对，同步用软件进行解析，筛选得到明确的特征肽段，以及适用的离子对。

液相部分：液相梯度和样品前处理优化

• 胰蛋白酶和木瓜蛋白酶双重酶解：经protein A捕获纯化后的DS-8201血清样品，用木瓜蛋白酶及胰蛋白酶双重酶解。

• 根据酶解结果，调整液相梯度，获取最优色谱方法。

• SD大鼠血清中，总抗体和结合型载荷计划检测范围为2~600nM，考察该检测范围内的线性、灵敏度、准确度、精密度、残留、基质效应、回收率和选择性。

结果与讨论

按照以上流程，我们开发了同时检测SD大鼠血清中DS-8201总抗体和结合型载荷的RPLC-MS/MS方法，分离时间仅为8分钟。采用DS-8201配制标准曲线2-600 nM, 标准曲线的拟合结果见表1。

表1. DS-8201总抗体和结合型载荷在SD大鼠血清中的线性范围

SD大鼠血清中的DS-8201在纯化提取后，可以用胰蛋白酶消化和木瓜蛋白酶消化的方法来检测总抗体、结合型载荷，需考察各项方法在2~600nM范围内的消化效率、基质效应、回收率和选择性。

通过比较曲妥珠单抗和DS-8201的胰蛋白酶消化效率，可以了解到该分析方法的消化效率可达到89%~100%，均可以满足分析要求。

同时，对采用胰蛋白酶消化后的肽段，用木瓜蛋白酶进行水解释放Dxd的效率也一并进行了考察（表3），并与向经过同样处理后的空白样品中，加入相同理论浓度的Dxd的样品进行比较，结果表明木瓜蛋白酶的水解效率为92%~98%，也可满足分析要求。

经过液相色谱条件优化，我们所选的特征性多肽和Dxd的残留均小于LLOQ，满足分析要求，LLOQ的色谱图见图3。

图3. 经木瓜蛋白酶和胰蛋白酶消化后大鼠血清中 DS-8201 的 LLOQ 样品色谱图：总抗体LLOQ (A)、结合型载荷LLOQ（B）

由于样品中化合物的浓度会随时间产生变化，因此需要了解在样品稀释后，检测到的总抗体和结合型载荷浓度是否与预期一致。经过考察，总抗体和结合型载荷的稀释一致性偏差均小于15%，满足分析要求。

液相-质谱平台检测ADC的生物分析策略

液相色谱-质谱平台可以检测ADC的各类相关研究对象，包括上述的总抗体、结合型载荷，也包括结合型抗体、游离型载荷、总载荷、裸抗、DAR值和生物转化等。为了区分这些研究对象，需要特别注意挑选免疫捕获时所用的试剂、酶解时所选用的酶以及合适的液相色谱-质谱平台，其分析策略树如图4所示。

例如，对于总抗体、结合型载荷与ADC的生物转化，一般采用将生物基质中的所有ADC相关大分子免疫捕获出来后，再进行后处理的方法。根据ADC浓度、生物基质的不同以及对特异性的不同要求，蛋白A/G、抗人抗体、抗独特型抗体或是靶蛋白都可能用在此处。

如果用液相色谱-质谱平台检测结合型抗体，可使用通用型免疫捕获试剂，利用LC-HRMS检测并区分不同DAR值的ADC；使用抗载荷抗体进行捕获，并使用特征性多肽法进行定量，则在结合型抗体的检测中可以获得较好的灵敏度。

图4. ADC相关研究对象的生物分析策略树

用质谱平台检测ADC中的总抗体和结合型载荷，拓展了临床前的样品检测能力。在没有对应的抗载荷抗体的情况下，ELISA方法不能用于检测结合型抗体的检测。但采用免疫富集后经过酶水解的样品，LC-MS/MS质谱可以精准检测特征性肽段和小分子载荷，从而可以实现结合型载荷和总抗体的检测, 减少对于特定抗体和试剂的要求，并可以同时达成平均DAR值检测，这也为研究人员提供了除高分辨质谱之外的检测ADC的DAR值手段，降低了对检测平台的要求。

结语

本文以DS-8201为例，介绍了如何开发大鼠血清中总抗体和结合型载荷的LC-MS/MS方法，采用基本相同的样品处理步骤，实现了在同一个检测平台下检测多项指标，大大简化了在动物样品中检测ADC的操作，并且经过方法优化，使两者的检测限均达到了2nM，可以满足药代动力学研究中的检测需求。

药明康德药性评价部（DMPK）已经建立了ADC药物测试实验平台，用于评估ADC药物在动物体内的变化情况，并配备了LC-MS/MS、LC-HRMS、ELISA、MSD、流式细胞仪和QWBA等各项检测能力，可满足不同的需求，为客户提供一体化的服务，助力加速新药研发进程。

图5. DMPK整合性生物分析平台

作者：余志仁，章何峰，张文翰，李陟昱，王洪梅，邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1700个新药临床研究申请（IND）。 

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