抗体偶联药物（ADC）临床前PKPD研究策略与实践

抗体偶联药物（Antibody drug conjugate, ADC）结构上包括了靶向细胞的抗体（通常是癌细胞）、毒性载荷分子和连接子的药物，这种药物设计旨在实现更精确的载荷分子的递送和杀伤，减少对正常细胞的损伤。相对于传统的化疗药物，ADC药物具有靶向性高和治疗窗口宽的特点。目前针对不同肿瘤适应症的ADC药物研发呈现百花齐放的态势，ADC药物有望引领精准化疗的新时代。本文将介绍ADC药物研发的主要考量点，并重点阐述ADC药物临床前PKPD的研究内容和实践结果。

一、ADC药物研发的主要考量点

ADC药物结构的复杂性决定了ADC药物的研发和优化有很多考量点，例如，

• 抗原靶点的选择，需要考虑抗原表达谱（癌细胞vs正常细胞），抗原介导的内吞，抗原亲和力（高抗原表达导致的结合位点障碍）等。

• 抗体骨架的选择，需要考虑FcγR、FcRn等受体介导功能等。

• 载荷的选择，需要考虑毒性、作用机理、半衰期、极性（亲脂性）、其外排转运体等。通常载荷的选择上比较保守，大部分ADC主要选择一些已经充分研究的毒素家族，例如卡齐霉素类（calicheamicins），奥瑞他汀类（auristatins），美登素类（maytansinoid），拓扑异构酶I抑制剂类（topoisomerase I inhibitors）以及吡咯并苯二氮卓类（pyrrolobenzodiazepine，PBD）毒素等。

• 偶联位点的选择，需要考虑偶联载荷数量、定点/非定点偶联、DAR值均一性等。

• 连接子的选择，需要考虑载荷释放方式（可切割或不可切割）、亲疏水性、载荷释放部位（溶酶体或肿瘤细胞微环境）等。

图1. ADC药物研发主要考量点示意图

二、ADC药物PKPD研究内容

ADC药物的临床前药效学研究（pharmacodynamics）主要关注药物对体外细胞模型和动物肿瘤模型的作用及治疗效果。ADC药物的临床前药代动力学（pharmacokinetics）是研究其在体外或动物体内的ADME（即吸收、分布、代谢、排泄）的特征。将两者结合在一起的PKPD研究，是关注药物量效的关系，通过经验或者数学模型总结和解析ADC药物的行为和效应。

因抗体偶联药物多样的组成成分和作用机理， ADC药物的PKPD研究也表现其特点和挑战。例如其PK特性会表现出抗体和小分子的双重特点，需要定量了解不同分子形式（例如ADC结合物、总抗体和游离的小分子毒素）的PK性质；而ADC药物的药效主要取决于肿瘤细胞中游离的小分子毒素和活性代谢物的浓度，同时由于多种药理作用机制（靶点效应、旁观者效应等）的存在，ADC药物的PD研究需要更全面的考察^[1]。

如图2列出ADC药物临床前建议开展的药代动力学和药效学研究。PK研究临床前主要包括体外稳定性研究、体内PK和组织分布的研究。体外稳定性研究通常对于ADC药物的早期研发是非常关键的，通过研究ADC药物在血浆/全血体系，溶酶体或者酸化的肝S9和肝匀浆体系或肿瘤细胞体系的稳定性和代谢产物鉴定（met ID），可以很好的帮助理解ADC药物的药理药效和潜在的安全性风险。体内PK和组织分布的研究则可以帮助理解ADC药物的体内的ADME特征，药物各组分暴露量（例如总抗体或者游离载荷）以及不同器官的暴露量，其中组织分布研究也可以使用肿瘤模型动物进行考察^[2]。

ADC药物的PD研究也分为体外和体内研究，体外研究主要包括抗原亲和力、FC介导的肿瘤杀伤（ADCC/ADCP）、ADC内化作用、载荷MOA研究、体外肿瘤细胞杀伤以及旁观者效应考察等。体内PD研究主要使用肿瘤动物模型评估ADC体内药效，这里主要使用小鼠肿瘤模型，包括CDX（cell line derived xenograft）和PDX（patient derived xenograft）模型，CDX模型具有一致遗传性和表型特征并且易于建立，PDX模型能够更加准确地反映人类肿瘤的异质性和复杂性。

值得注意的是，由于CDX 和PDX模型均基于免疫缺陷小鼠构建，在需将免疫系统功能纳入考量（如ADC药物与免疫检查点抑制剂联药测试，或者payload为免疫调节性药物）的情况下，可以利用人源PBMC（peripheral blood mononuclear cell）或HSC（hematopoietic stem cell）人源化动物构建的肿瘤模型，来评估免疫调节相关ADC或者与免疫制剂联合使用的药效^[3]。

图2. ADC药物临床前PKPD研究示意图，其中标*项目对于全新的linker/payload的ADC研发意义更大

越来越多的ADC药物研究应用模型的方法将PK、PD和安全性数据进行整合^[4]，以满足不同阶段ADC药物研发的需求。由于ADC具有多种清除途径以及存在多种分析物的复杂的PK特征，其PK模型也相对比较复杂，通常用二房室模型或PBPK模型计算清除率、解离、代谢速率等参数，分析ADC的ADME特征。此外，结合药效学数据的PKPD模型可以帮助更好地理解ADC药物在肿瘤模型中的药理药效以及潜在的安全性风险。

三、DS8201体内PKPD验证实验

下面展示一个ADC药物临床前PKPD体内研究的验证实验，在HCC1954和JMT-1荷瘤小鼠模型中进行DS8201药物的PKPD研究。HCC1954是从人原发性IIA 期、3级浸润性导管癌中分离出来的上皮乳腺癌细胞系，JIMT-1是从人导管癌胸腔积液中建立的乳腺癌细胞系，两者都是常用的HER2抗原表达的肿瘤细胞系模型。其中HCC1954的HER2表达量更高，属于HER2高表达模型。

该验证性PKPD实验设计了六个组，分别是DS8201在HCC1954和JIMT-1肿瘤模型中的高、低剂量实验组以及对照组。实验组分别采集给药后的血浆（9个时间点），终点采集肿瘤和12种组织（4个时间点），组织包括脑、肝、脾、肺、心、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、卵巢和子宫。采集的样品分别进行总抗体（Total antibody），偶联抗体（Conjugated antibody）以及游离载荷（Free payload）的生物分析（ADC生物分析方法可以参考文章：整合性生物分析在抗体偶联药物（ADC）DMPK研究中的应用）。

实验在免疫缺陷小鼠上分别接种培养的HCC1954和JIMT-1肿瘤细胞，待肿瘤长至~200mm3大小时进行DS8201单次静脉（IV）给药实验，选取肿瘤体积（Volume, mm3）作为主要药效学指标，一周两次测量肿瘤体积和小鼠体重。如下图所示，其中DS8201高低剂量组在HCC1954模型中的肿瘤（体积）抑制率（Tumor Growth Inhibition，TGI）分别达到122.21%和108.78%（图3），在JIMT-1肿瘤模型的抑制率达到81.56%和63.2%（图4）。可以看到HER2高表达模型对于DS8201药物的响应更加明显，和目前大量的ADC临床数据一致。

图3. HCC1954肿瘤模型中高低剂量DS8201给药的肿瘤体积与时间关系，以及肿瘤抑制率的计算。图A中X-Axis是给药后天数，Y-Axis是肿瘤体积；图B中X-Axis是给药后天数，Y-Axis是小鼠体重变化百分比（%）。

图4. JIMT-1肿瘤模型中高低剂量DS8201给药的肿瘤体积与时间关系，以及肿瘤抑制率的计算。图A中X-Axis是给药后天数，Y-Axis是肿瘤体积；图B中X-Axis是给药后天数，Y-Axis是小鼠体重变化百分比（%）。

在PKPD实验中，伴随着主要药效学指标的考察，我们同时进行了DS8201 ADC药物的总抗体、偶联抗体和游离载荷在系统循环和肿瘤组织的药代动力学特征考察，以及主要组织的组织分布考察。其中系统循环（血浆）和肿瘤组织中的总抗体和偶联抗体的PK曲线如图5所示，同时测量了游离载荷在系统循环（血浆）和肿瘤中的浓度，具体PK曲线如图6所示。

从系统循环PK数据上看，DS8201在系统循环中的稳定性较好，血浆中DS8201总抗体和偶联抗体浓度在3周跨度的采样周期中基本无较大差异，并且游离载荷仅在高剂量组给药早期可以检测到，并且系统循环中总抗体和偶联抗体暴露量和给药量之间呈现较好的线性关系。但是从肿瘤数据中看到，肿瘤中的总抗体和偶联抗体暴露量和给药剂量之间呈现非线性关系，主要原因是肿瘤的ADC分布受到靶点抗原表达等多方面的影响，提示ADC肿瘤暴露量和药物代谢速度以及肿瘤模型本身有关。

另外可以看到肿瘤中的总抗体和偶联抗体暴露量与肿瘤模型抗原表达量呈现正相关性。相同剂量组的抗原高表达模型总抗体和偶联抗体暴露量高于抗原低表达模型，相差1.5倍。相同剂量组的抗原高表达模型和低表达模型的游离载荷暴露量差别更大。高表达抗原的肿瘤细胞更利于ADC药物的内吞以及游离载荷的释放，这也ADC既往相关研究一致。结合PD肿瘤抑制药效结果，更高的总抗体、偶联抗体以及游离载荷的暴露量与TGI呈现正相关。

图5. HCC1954和JIMT-1肿瘤模型中高低剂量DS8201给药的总抗体和偶联抗体PK曲线图。图A是HCC1954模型肿瘤组织中总抗体和偶联抗体浓度和时间关系，其中X-Axis是给药后的天数，Y-Axis是药物在肿瘤组织中的浓度（µg/g），曲线图例参考图B；图B是HCC1954模型血浆中总抗体和偶联抗体浓度和时间关系，其中X-Axis是给药后的天数，Y-Axis是药物在血浆中的浓度（µg/mL）；图C是JIMT-1模型肿瘤组织中总抗体和偶联抗体浓度和时间关系，其中X-Axis是给药后的天数，Y-Axis是药物在肿瘤组织中的浓度（µg/g），曲线图例参考图D；图D是JIMT-1模型血浆中总抗体和偶联抗体浓度和时间关系，其中X-Axis是给药后的天数，Y-Axis是药物在血浆中的浓度（µg/mL）。

图6. HCC1954和JIMT-1肿瘤模型中不同剂量DS8201给药的游离载荷PK曲线图。图A是HCC1954模型肿瘤组织中游离载荷浓度和时间关系，其中X-Axis是给药后的天数，Y-Axis是药物在肿瘤组织中的浓度（ng/g）；图B是HCC1954模型血浆中游离载荷浓度和时间关系，其中X-Axis是给药后的天数，Y-Axis是药物在血浆中的浓度（ng/mL）；图C是JIMT-1模型肿瘤组织中游离载荷浓度和时间关系，其中X-Axis是给药后的天数，Y-Axis是游离载荷在肿瘤组织中的浓度（ng/g）；图D是JIMT-1模型血浆中游离载荷浓度和时间关系，其中X-Axis是给药后的天数，Y-Axis是游离载荷在血浆中的浓度（ng/mL）。

这些数据观察与结论与ADC药物研究文献报道基本符合^[5][6]，也进一步验证了载荷肿瘤内暴露量和药效之间的关系^[7]。同时我们也考察了DS8201的组织分布情况，在这里我们使用了药效肿瘤模型进行组织分布的考察，相对于使用健康动物模型可以更加符合药物的实际分布情况，这也是法规推荐的ADC药物组织分布考察方式^[8]。

组织分布数据发现，ADC主要分布在肿瘤组织中，在子宫、肺、肾、肝脏中也有少量分布，而游离载荷仅在小肠组织中检出微量，未在其他组织中检出。HCC1954和JIMT-1肿瘤模型中高低剂量DS8201在各类组织中暴露量如图7所示。从这些数据可以看到，抗原高表达模型的非靶组织暴露量普遍低于抗原低表达模型，ADC药物非靶组织分布也受到靶组织分布的影响。提示组织分布情况在正常动物和肿瘤模型动物可能不同。

图7. HCC1954和JIMT-1肿瘤模型的不同剂量DS8201组织暴露量分布图。图A和B是JIMT-1肿瘤模型的低高剂量组ADC药物组织暴露量，其中X-Axis是不同组织，Y-Axis是暴露量（AUC0_-last ng.h/mL）；图C和D是HCC1954肿瘤模型的低高剂量组ADC药物组织暴露量，其中X-Axis是不同组织，Y-Axis是暴露量（AUC_0-last ng.h/mL）。

小结

从DS8201的PKPD验证实验可以看到，Payload的靶组织释放即肿瘤组织中的payload浓度和肿瘤药效（TGI）的关联性很强。结合已报道ADC临床前和临床数据，我们建议在ADC药物早期研究中，关注体外ADC内化研究，体外稳定性研究和体内PKPD研究等。对于新型的Payload和linker，还需要关注ADC payload靶组织和非靶组织释放研究，旁观者效应研究，payload或主要代谢产物体外ADME研究（特别是外排转运体）和体内ADME研究，体外和体内主要代谢产物鉴定研究（met ID）等。

结语

在药物早期发现阶段，ADC药物的药效是主要关注点，同时药物的药代动力学特征也很重要，需要评估ADC候选药物的稳定性以及生物转化过程，即了解载荷如何从抗体中释放，并在杀死癌细胞的同时不达到危险的系统暴露水平。DMPK研究可以阐明ADC药物的疗效和潜在毒性之间的联系，这有助于药物研发者选择合适的连接子和载荷以及更好地设计抗体部分。对于候选ADC药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性的研究，再结合体内PK分析的数据，将决定该药物是否可能成为有效的治疗药物。

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作者：周毛天¹，王雨芳²，项健²，李惠惠¹，邢丽丽¹

编辑：钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

¹药明康德测试事业部药性评价部团队；²药明康德生物学业务平台体内药理学部

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

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