NTCP转运体在药物研发中的应用简介

2012年，中国科学家李文辉博士的团队发现Na⁺-牛磺胆酸共转运多肽（Na⁺-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）为乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）和丁肝病毒（Hepatitis D Virus，HDV）的共同受体，揭开了乙肝和丁肝药物开发的新纪元。因其在推动乙肝科研和治疗方面做出的杰出贡献，李文辉博士于2020年11月获得了全球乙肝领域最高荣誉奖——“巴鲁克•布隆伯格奖”，2022年8月21日又获得未来科学大奖的“生命科学奖”。近年来，以NTCP为靶点的病毒进入抑制剂的开发已成为肝病药物研发的主流。2020年8月，吉利德（Gilead）公司研发的全球首个以NTCP为靶点、用于治疗丁肝的新药布列维肽（Bulevirtide）经欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）获批上市。2021年11月，吉利德公司也向美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）提交了该药用于治疗丁肝的上市申请。本文将介绍NTCP对肝炎病毒的作用及其在胆汁酸（盐）循环中的功能，阐述其在药物研发中的应用。

一、NTCP的结构

NTCP是第十个溶质转运蛋白家族（solute carrier family 10，SLC10）中第一个被发现的转运体蛋白（SLC10A1）^[1]，主要位于肝细胞的基底外侧膜上。人的NTCP基因长度为21.4 kb，定位于染色体6q24和14q24，编码349个氨基酸^[2]。NTCP是一种多重跨膜蛋白，具有9个跨膜结构域（图1）^[3，4]。

图1. NTCP跨膜拓扑图（摘自Jae-Hyun Park. （2022年））

二、NTCP的功能及其在药物研发中的应用

NTCP是乙肝病毒和丁肝病毒的共同受体，介导病毒入侵肝细胞；其对胆汁酸（盐）在体内的调控发挥着重要的作用，主要转运胆盐和硫酸化化合物，同时也能够介导其它底物的转运，例如甲状腺激素、药物和毒素等^[5]。

2.1 NTCP与肝炎病毒

肝炎药物的研发进展

据统计，病毒性肝炎每年导致全球约130万人死亡，主要是由于发展为慢性肝病和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。其中大约95%的患者死亡是由HBV和丙肝病毒（Hepatitis C Virus，HCV）引起^[6]。截至22年8月，全球约有2.5亿人感染慢性肝炎病毒^[7]，主要为HBV、HCV和HDV，其中约5%的HBV患者同时感染了HDV。HDV是一种缺陷病毒，必须在HBV或其它嗜肝DNA病毒的辅助下才能复制并组装成具有感染性的病毒颗粒。HDV合并感染加快了HBV感染进程，且对HBV-HDV合并感染的治疗效果较差^[8]。针对慢性HBV感染，临床上主要有两类治疗药物：干扰素（IFNα）和核苷类似物（表1），用于调节免疫或者抑制病毒复制。虽然这些治疗方法可以一定程度减缓肝炎恶化，但无法实现临床治愈，且在大多数情况下，患者需要终身服药^[9]。对于慢性HBV-HDV合并感染的患者，此前的治疗方案仅限于干扰素及其聚乙二醇化衍生物。

表1. 临床治疗乙肝的主要药物类型及其优缺点

慢性HBV和HDV感染是世界范围内导致肝脏疾病和癌症的主要原因，NTCP作为HBV和HDV的共同受体，在病毒进入肝细胞中起着关键作用。2020年8月，Gilead公司研发的全球首个以NTCP为靶点、用于治疗丁肝的新药Bulevirtide经EMA获批上市，其通过阻止HDV/HBV病毒入侵肝脏细胞，有效地阻止了病毒在肝脏内的扩散。基于NTCP作为HBV和HDV的共同受体，Bulevirtide在治疗乙肝方面的研究也已进入临床Ⅱ期。NTCP作为HBV和HDV感染的功能受体的发现为新的抗病毒策略开辟了新的前景^[10]。表2列举了已获批或正在开发中的治疗HBV感染的进入抑制剂，其中包含了多种NTCP抑制剂^[11]。也有研究表明，NTCP还可以通过调节肝脏中的先天抗病毒免疫应答来调节肝细胞的HCV感染^[12]。

表2. 乙肝病毒进入抑制剂

*摘自Herrscher, C.（2020年）及全球乙肝新药进展（2022年7月）

NTCP对肝炎病毒的作用

乙肝病毒通过L-乙肝表面抗原（L-HBsAg）的pre-S1结构域与肝细胞质膜上的NTCP结合，之后病毒颗粒被包裹，核衣壳被运输到受感染细胞的细胞核，在那里释放部分双链松弛环状DNA（图2）。然后，宿主的DNA修复机制将进入的DNA转化为共价闭环DNA（cccDNA），cccDNA被组蛋白和非组蛋白包装成染色质，形成病毒的微染色质。该微染色体是HBV的转录模板，是HBV生命周期中关键的病毒基因组中间体，也是肝细胞核中病毒基因组的储备库，它通过核衣壳的细胞内循环和持续感染新的肝细胞来补充。因此，NTCP对HBV入侵肝细胞起着关键作用。

图2. NTCP与HBV、HDV、HCV的相互作用模型（摘自Eller, C. (2018年)）

NTCP在肝炎药物研发中的作用

NTCP被鉴定为长期寻找的pre-S1特异性HBV受体，推动了HBV的向肝性和物种特异性研究^[13]。靶向HBV pre-S1结构域与HBV/HDV进入所需受体NTCP之间的相互作用是一种很有前途的阻断两种病毒入侵的策略。在NTCP被鉴定为HBV/HDV受体之前，HBV pre-S1的进入抑制剂就被证明在体外和体内能有效地抑制HBV感染^[14,15]。Bulevirtide（也称为肌蛋白B或MyrB）也是一种肉豆蔻酰化的pre-S1衍生肽，能够有效阻止HBV在体内传播，及其在感染的人肝细胞cccDNA池中扩增^[16]；它是第一个靶向NTCP的HBV/HDV进入抑制剂，具有较高的安全性，对胆汁酸的摄取仅有轻微干扰^[17,18]。

NTCP作为HBV/HDV进入受体的鉴定加速了几种新的潜在进入抑制剂的开发和发现。肉豆蔻酰化的pre-S1衍生肽可以干扰NTCP的生理胆汁酸转运功能，因此，NTCP抑制药物也可能会阻断HBV感染^[19]。NTCP作为唯一一个被发现的HBV/HDV受体是这些病毒生命周期研究中的一个里程碑。这一发现使研究HBV/HDV进入宿主细胞及病毒-宿主相互作用方面进展显著。此外，基于这一发现，采用稳定表达NTCP的转染细胞系的新型感染模型系统，可以详细研究病毒生命周期的早期过程。通过对细胞系中真实感染的研究，这些模型系统将有助于理解HBV cccDNA的形成和降解，这是实现HBV治愈最终目标的关键靶点。一项评估FDA批准治疗肝病药物的研究表明^[19]，NTCP的抑制剂对HDV进入有抑制作用，其中三个化合物，厄贝沙坦（Irbesartan）、依折麦布（Ezetimibe）和利托那韦（Ritonavir）在体外可抑制HDV感染^[20]。Ezetimibe对HBV感染的抑制作用已经被报道过，但之前并不了解其与NTCP的相互作用。2014年，Watashi等人确定环孢素A（Cyclosporin A）是一种靶向NTCP的HBV进入抑制剂^[21]。同年，科学家发现Cyclosporin A还可以抑制NTCP对胆盐的转运作用，同时发现其抑制HBV进入肝细胞是由于对NTCP受体的干扰。另有研究报道^[11]， HBV与NTCP的结合和普通配体与NTCP的结合产生相互竞争现象，因此，筛选得到对NTCP抑制强度较高的抑制剂可以为抗HBV药物的研发提供物质基础。靶向NTCP的HBV/HDV进入抑制剂抑制了NTCP的转运体功能，同时也损害了肝细胞对胆盐的摄取，增加胆汁淤积等不良反应的风险。有研究人员提出采用选择性抑制NTCP的方法，在不影响胆汁酸摄取的情况下抑制HBV进入。志村等科学家的研究结果表明，Cyclosporin A的衍生物SCY450和SCY995可抑制HBV/HDV进入，但不干扰NTCP转运体活性^[22]。也有科学家发现了一种低聚黄酮原花青素（PAC）及其类似物作为一种新的进入抑制剂，直接靶向HBV大包膜蛋白的pre-S1结构域，从而阻止其与NTCP的附着。通过直接靶向HBV颗粒，损害了HBV的感染性，而不影响NTCP介导的胆汁酸转运活性^[23]。

除在HBV和HDV进入肝细胞的过程中起关键作用外，NTCP还在HCV感染中发挥着重要的作用^[24]。研究发现NTCP为HCV感染的宿主依赖因子，进一步强调了其在病毒-肝细胞相互作用中的重要作用。NTCP靶向抗病毒药物增强先天抗病毒应答和参与宿主免疫系统清除感染的潜力可能是治疗所有嗜肝病毒，包括HBV、HCV和HDV的有用特性。表达人NTCP的动物模型系统将使病毒-宿主相互作用和抗病毒治疗成为可能。此外，NTCP已被确定为抗病毒靶点，一些靶向NTCP的分子正在临床开发中，其目标是在未来改进目前的治疗方法。

2.2 NTCP与胆汁酸（盐）循环

胆汁生成是肝脏的另一项重要功能。胆汁的主要成分是胆盐、磷脂和有机阴离子^[25]。在小肠中，胆盐几乎被定量回收并通过门静脉循环运回肝脏（图3）。在肝脏中，肝细胞重吸收胆盐并将其再次分泌到胆汁中，以进行持续的肝肠循环。胆盐是两亲分子，可作为胆汁清除水溶性差的物质（例如胆固醇）的载体。若胆盐在肝细胞内积聚，则会损害线粒体功能，因此具有细胞毒性^[26]。NTCP通过钠离子依赖的方式将结合型和游离型胆盐从血液向肝细胞中转运，将两个钠离子和一个胆盐分子一起转运^[27]，使其成为一个电生成转运体^[28]。值得注意的是，NTCP的表达不仅在各种病理生理情况下受到调节，而且也通过磷酸化/去磷酸化受到翻译后修饰的调控^[29]。在胆汁分泌受损的情况下，NTCP的表达通常会下调，以保护肝细胞免受细胞毒性胆盐积累的伤害。若NTCP被抑制，影响了胆盐的重吸收，也会影响胆汁的清除，增加血液中胆酸盐的含量，产生毒副作用。辉瑞（Pfizer）公司的降糖药曲格列酮（Troglitazone）及其主要代谢产物为参与胆汁排泄与胆酸盐转运的胆酸盐外排泵（Bile Salt Export Pump，BSEP）的抑制剂，会抑制胆酸盐排出。同时，曲格列酮也是NTCP的抑制剂，可减少胆酸盐被重吸收回肝脏。这样就同时增加了肝脏及血液中胆酸盐的含量，导致胆汁淤积型肝病（图4）（药物性肝损伤（Drug Induced Liver Injury，DILI）的临床表现之一）的发生。曲格列酮也因此被英国药物与保健品管理局(Medicines and healthcare products regulatory agency, MHRA)、美国FDA等监管机构要求撤销。

图3. 转运体介导的胆汁酸循环（摘自Fiorucci, S.（2019年））

图4. 曲格列酮引起DILI的机制

三、体外NTCP模型及其主要应用

药明康德DMPK体外ADME渗透性与转运体团队引进了高表达人NTCP的HEK293细胞，成功建立了体外NTCP底物和抑制评估模型。实验中采用的已知底物及阳性抑制剂的相关验证数据与文献报道值高度一致^[32，33]（表3）。牛黄胆酸（Taurocholate）是经典的NTCP底物，为减少内源性干扰，提高实验灵敏度，我们选取了氘代的牛黄胆酸盐（Taurocholate D4）作为NTCP的已知底物。经测试，Taurocholate D4的K_m值（转运反应达最大速度一半时的底物浓度）为12.4 ± 0.82 μM。阳性抑制剂Cyclosporin A及利托那韦（Ritonavir）对NTCP抑制的IC₅₀值分别为0.93 ± 0.07 μM和1.58 ± 0.77 μM。我们选取了抑制效果更佳的Cyclosporin A作为NTCP底物评估实验的抑制剂。HEK293-NTCP及HEK293 MOCK细胞对Taurocholate D4的摄取比值（HEK293 NTCP及HEK293 MOCK细胞转运化合物的转运活力的比值）为30.9 ± 6.07、Rs/Ri值（不含和含有阳性抑制剂时，HEK293-NTCP细胞转运化合物的转运活力的比值）为13.9 ± 3.79；摄取比值及Rs/Ri值均大于2，HEK293-NTCP细胞展现出良好的摄取底物的能力，阳性抑制剂在测试条件下能够有效地抑制NTCP对底物的摄取。

表3. 药明康德NTCP模型验证数据与文献值对比

表4. NTCP摄取已知底物的实验数据

研究显示^[30，31]，NTCP作为转运体与底物，如牛黄胆酸盐（Taurocholate，TCA）的结合区域与HBV及HDV通过NTCP进入肝细胞的区域重叠（图5），因此，可通过NTCP转运体的抑制剂或底物阻断HBV或HDV与NTCP结合，来阻止病毒入侵，以控制疾病的发展及治疗疾病。利用体外模型，快速筛选NTCP的潜在抑制剂或底物，为研发治愈HBV/HDV新药开辟了新思路。此外，NTCP对结合型胆酸盐具有高亲和性，牛黄胆酸结合物能被NTCP特异性地摄取入肝细胞，成为一种可能的肝细胞癌靶向治疗方法，由此，稳定表达NTCP的细胞模型也可为研究肝脏靶向药物提供研究工具。再则，NTCP作为特异性表达于肝脏的摄取类转运体，对于药物在机体内的处置也发挥着重要的作用。外源性物质进入肝脏后进行代谢失活或代谢激活，研究NTCP也能对药物性肝损伤进行预判，因此，研究药物与NTCP的相互作用还可以为临床合理用药提供一定的依据。借助于NTCP模型，还可以更深入地研究乙肝和丁肝的感染机制。

图5. NTCP转运体底物结合方式（a）及NTCP受体结合方式（b）（摘自Jinta Asami, （2022年））

结语

NTCP既是胆盐吸收入肝的重要转运体，又是HBV、HDV的功能性受体。体外模型的建立，为快速筛选NTCP的潜在抑制剂或底物，研发治愈HBV、HDV新药提供了崭新的研发工具，对药物安全性评估也具有十分重要的意义。

作者：王羽茜，张璇，熊涛，陈根富

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

点击此处可与我们的专家进行联系。