Bioanalysis期刊发表：非病毒载体基因药物的生物分析

近年来，获批和进入临床的基因治疗药物管线越来越多，为许多遗传性和获得性疾病的治疗带来了新希望。与靶向功能蛋白的常规治疗相比，基因治疗可以通过对特定致病基因进行激活、抑制和编辑，以达到持久或治愈的效果。然而，将DNA/RNA递送至靶细胞面临诸多障碍，常用递送策略包括病毒载体和非病毒载体。近期，药明康德药性评价部生物分析团队在Taylor & Francis旗下期刊Bioanalysis上发表了一篇关于非病毒载体基因药物的生物分析的文章，总结了基于非病毒载体基因治疗药物的多种生物分析策略，及其生物分析的挑战和前景。本文将解读此篇文献，介绍非病毒载体基因药物各组分包括基因货物、递送载体和表达蛋白的药代动力学（PK）/毒代动力学（TK）、生物分布和免疫原性评价策略。

一、非病毒载体基因药物简介

基因治疗药物通常由基因货物及其载体组成。基因货物包括短链核酸（如ASO、siRNA、miRNA）和长链核酸（如DNA、mRNA、saRNA、CRISPR/Cas9等基因编辑组件），其作用机制各异，包括ASO介导的占位降解或基因调控、siRNA或miRNA介导的降解、外源mRNA的翻译、外源DNA的转录与翻译，以及CRISPR/Cas9或类似系统的基因删除或修改等（见图1）。裸露的DNA或RNA链非常脆弱，因此需要合适的基因载体来保护遗传物质，防止其降解，确保其有效递送到靶位点，并减轻机体的免疫反应。

图1. 非病毒载体基因治疗药物的作用机理（MOA）

基因治疗载体通常分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有高转染效率和稳定的基因表达，但存在毒性、免疫原性、致癌性、高成本等局限。而非病毒载体具有免疫原性低、可生物降解、易于合成、生产成本低、包裹基因材料大小灵活等优点。广泛研究的非病毒载体包括聚合物、脂质载体和无机纳米颗粒^[1]。

系统药物浓度是评价常规药物疗效和毒性的关键因素。然而，基因治疗的体循环半衰期远低于组织半衰期，组织暴露主要决定其药理作用和毒性。因此，有必要了解非病毒载体基因药物各组分的PK/TK、生物分布和免疫原性特征。

二、非病毒载体基因治疗药物的生物分析

为了充分了解各组分的PK和生物分布规律，非病毒载体基因治疗药物的生物分析大致可分为四个部分，包括基因货物、载体或其代表组分、靶标或表达蛋白的生物分析以及免疫原性评价（图2）。

图2. 非病毒载体基因治疗药物的生物分析策略

基因货物的生物分析

根据长度基因货物可分为寡核苷酸（长度通常小于50个碱基）和长链核酸（碱基从数百到数千不等）。

寡核苷酸

寡核苷酸生物分析平台的选择取决于检测要求，如灵敏度、区分代谢物的能力、多重检测、通量和定量/半定量等。寡核苷酸绝对定量分析平台包括LC/MS、LBA、hybrid LBA-LC/MS和PCR平台，其优缺点和应用场景如下。

• 基于LC/MS的方法

基于LC/MS的方法因其特异性和宽定量范围而被广泛用于寡核苷酸生物分析。与LBA和qPCR平台相比，其区分代谢物与母体寡核苷酸平行监测的能力极佳，并可在一次试验中同时定量和监测多个寡核苷酸及其代谢物。但需注意样品制备和提取步骤，以确保试验的回收率和耐用性。常见策略包括蛋白沉淀、酶消化、液-液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）等^[2]。

• 基于LBA的方法

基于LBA的方法，如杂交酶联免疫吸附试验（ELISA）或杂交电化学发光方法（MSD）可用于寡核苷酸定量。其具有高灵敏度和稳健性，而且样品制备简单，提高了分析的通量。但其动态范围较窄，区分寡核苷酸及其代谢物的能力较差。常用的杂交分析包括基于夹心法、竞争性杂交法、一步杂交法、两步杂交-酶连接法和双重酶连接杂交法等。

• 基于hybrid LBA-LC/MS的方法

近年来，hybrid LBA-LC/MS方法广泛应用于生物样本中寡核苷酸的定量。这种方法结合了LC/MS和LBA平台的优点，灵敏度高且特异性强，利用捕获探针（通常为互补DNA序列）与寡核苷酸特异性杂交，以实现高效的样品纯化。尽管在杂交过程中仍可提取较短的代谢物，但LC-MS分析可将其与全长寡核苷酸区分，并可在一次试验中同时定量和监测。该方法已应用于ASO、siRNA和miRNA的分析，成为寡核苷酸分析强有力的工具。

• 基于PCR的方法

PCR是一种强大且高灵敏的寡核苷酸定量技术。但寡核苷酸通常太短，无法容纳足够的引物对和探针。为解决该问题，多种扩展目标寡核苷酸长度的方法被开发，如茎环RT-qPCR、双尾RT-qPCR、引物延伸qPCR、基于酶连接的qPCR等。PCR试验难以区分完整寡核苷酸与其较短代谢产物。由于PCR方法的固有变异，其精密度和准确度的接受标准通常远高于传统的LC/MS或LBA方法。

图3. 寡核苷酸不同生物分析平台的优缺点

长链核酸

对于长链核酸，由于其极高的分子量和较差的电离效率，几乎无法通过LC/MS定量分析。但LC/MS方法是表征mRNA的有力工具，包括基于核酸酶的序列图谱、RNA转录后修饰（PTM）评价和完整性评价（polyA尾和帽）。酸水解同位素稀释LC/MS方法可用于定量纯的或基于基质中的LNP包裹mRNA。通常，分支DNA（bDNA）、qPCR和基于dPCR的平台主要用于长链核酸的定量。

与bDNA方法相比，PCR方法具有更高的灵敏度，有助于基因治疗药物的风险评估，以及跨越血-乳腺、血-胎盘和血-脑屏障的风险评估。此外，PCR平台在定制化检测方面提供了较大灵活性，可以满足不同的研究要求^[3]。其缺点在于通常需要对样品进行前处理以提取核酸，这可能引入更多的误差和影响回收率。值得注意的是，基于PCR的方法验证和样本分析目前还没有官方指南定义接受标准，基于PCR的临床前和临床阶段的生物分析仍然以研究目的为导向进行实验设计（fit-for-purpose）。

非病毒基因载体的生物分析

一些非病毒载体的安全性和ADME特性已有广泛的研究，许多组分如LNP结构中的胆固醇、磷脂和合成聚合物（如PEG/PLA）被认为是安全的，通常无需监测这些载体或其组分的PK和生物分布。但对于新载体组分或ADME特性尚未得到充分研究的成分，需要了解其生物分布、代谢和清除途径。

非病毒载体具有较大的分子量、异质性和复杂的组分，其生物分析相较于传统小分子药物更具挑战性。基于聚合物的载体在单体数量和链结构（线性或分支）方面存在差异，基于脂质的载体如LNP通常由磷脂、胆固醇、阳离子/可电离脂质和PEG化脂质组成，无机纳米颗粒的物理性质以及颗粒大小可能都不同，而生物分析方法的选择通常取决于载体的物理性质和化学成分。可采用多种策略评价非病毒基因载体的PK和生物分布，包括LC/MS、电感耦合等离子体（ICP）-MS、LBA、放射性标记和荧光标记等。如果难以将载体作为整体进行监测，也可以通过监测替代成分来代表整个载体的药代动力学和生物分布特征。

基于LC/MS的方法广泛应用于聚合物和LNP替代脂质组分的生物分析。PEG载体的定量可使用基于酶标板或细胞的ELISA方法。通过放射性核素标记纳米颗粒可在体内示踪载体，半定量研究其生物分布、药物靶向性和清除率。在临床前研究中，Patisiran、BNT162b2和mRNA-1273均使用定量全身放射自显影（QWBA）研究了放射性标记载体在大鼠组织中的分布^[4]。荧光显微镜可用于监测纳米颗粒的细胞和组织水平分布，但需考虑天然组织的自发荧光干扰。ICP-MS和电子显微镜可用于基于金属的无机纳米颗粒的PK和生物分布评价。对于不可生物降解的聚合物或无机纳米颗粒，需要开展质量平衡研究以确定排泄途径和鉴定代谢产物。

表达蛋白的生物分析

非病毒载体基因药物表达蛋白的生物分析与传统蛋白药物相似。多种分析平台可用于其PK和生物分布评价，包括LBA、LC/MS、hybrid LBA-LC/MS、western-blot（WB）和免疫组织化学（IHC）等。LBA定量可应用多种平台，免疫亲和的原理类似，但信号产生机制各不相同。ELISA已用于检测多种mRNA编码的疫苗抗原、治疗性抗体和替代疗法的表达蛋白。

最近，基于LC/MS的方法已广泛用于蛋白治疗药物的生物分析，通过对目标蛋白的酶解，随后定量一个或多个特征肽段来实现对目标蛋白定量。高丰度蛋白去除和免疫捕获富集（hybrid LBA-LC/MS）方法可进一步提高灵敏度^[5]。与LBA法相比，基于LC/MS的蛋白定量方法在选择性、结构域映射和多重检测方面具有优势。筛选合适的抗体对以区分基因治疗表达蛋白与其相似的内源性蛋白可能是一个挑战，然而基于LC/MS或hybrid LBA-LC/MS的特征肽段定量方法是区分这两者的有力工具。

免疫原性评价

非病毒载体基因治疗药物的免疫原性评价应考虑针对基因货物、基因载体和表达蛋白的免疫原性，可能还需要监测预存抗药抗体（ADA）。抗RNA/DNA、抗载体和抗表达蛋白抗体的生物分析方法应分别开发和验证，应使用基于风险的方法评估非病毒载体基因治疗药物的潜在免疫原性。对于LNP-mRNA药物，当前数据表明在无自身免疫性疾病的情况下，mRNA本身不具有显著的免疫原性诱导，通常认为抗RNA的ADA风险较低，但mRNA介导的蛋白替代治疗应监测抗表达蛋白的ADA。通常认为LNP载体的免疫原性较低，然而LNP载体上的PEG成分可诱导抗PEG的ADA，可能影响LNP-mRNA疫苗的安全性和有效性^[6]。抗RNA/DNA的ADA和抗载体的ADA测定可以使用微量滴定板的ADA直接测定法进行。除评价体液免疫原性外，还可通过ELISpot和细胞内细胞因子染色（ICS）方法监测特异性T细胞的细胞免疫原性。

其他生物分析相关思考

在非病毒载体基因治疗药物的生物标志物分析中，应以研究目的为导向进行实验设计。根据基因治疗药物的设计、结构和作用机制（MOA）选择合适的生物标志物，并在药物开发过程中采用不同的策略。在发现阶段，可采用探索性策略甚至半定量分析；当进入试验性新药（IND）或临床阶段时，需要在符合监管要求的环境中对方法进行探索性验证/确证，进一步证明试验的精密度、准确度、选择性、耐用性和系统适用性。

在样品制备方面，定量准确性受交叉污染、采样区域偏倚及基因货物稳定性等的影响。关注这些因素可确保定量的准确性，降低组织分布研究中的误差。

此外，对于基因治疗，许多监管文件提到应使用非传统生物分析方法来评估临床终点的安全性。然而，关于接受标准和验证项目的详细信息仍然很少。可参考FDA、EMA和ICH的类似指南，如寡核苷酸的杂交试验和mRNA/DNA的bDNA试验可以参考LBA监管指南，基因载体（如阳离子脂质或PEG脂质）的LC/MS试验可以参考色谱监管指南。PCR方法推荐用于DNA/RNA定量，但具体验证项目和标准尚未明确，一些白皮书或文献提供了相关标准化建议^[7,8]。

结语

近几十年来，基因治疗相关研究取得了显著进展，非病毒载体已成为更安全、更灵活的递送选择。为了能够进行准确和有效的PK/PD评价和免疫原性评估，必须建立适合的生物分析策略。随着技术进步，越来越多的生物分析策略可供选择，提供了更高的准确性和灵敏度。基因治疗药物的增长趋势也将为生物分析科学家、技术供应商和监管机构提供更多的机会，以共同建立未来技术监管的最佳实践。

药明康德DMPK部门具备丰富的临床前生物分析经验，目前在非病毒载体基因治疗药物的生物分析上，已承接几十个项目，积累了丰富的分析经验，可以帮助客户快速完成临床前生物分析方法的建立和验证，满足药代动力学的FDA/NMPA/TGA的IND申报要求。目前我们建立的非病毒载体基因治疗药物的生物分析平台可帮助开发者在不同的研究阶段更加高效/准确的评估该类药物体内/体外的ADME特征，更好的理解其药效与安全性之间的关系，为后续的安全性评价和临床研究打下坚实的基础。

作者：周毛天，张雪，颜欢，宋苗苗，邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

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