生物基质中分析物不稳定的原因及解决策略

在临床前药代动力学研究中，当对分析物的理化性质和生物学活性未全面了解时，确定分析物在生物基质中是否稳定至关重要，这关系到能否准确测定其浓度，并正确计算相关药代动力学（PK）参数。本文将介绍分析物不稳定的原因，并结合药明康德药性评价部生物分析团队的经验，为分析物在临床前生物分析过程中的不稳定问题提供一些建议和解决思路。

一、不稳定原因及解决思路

分析物的不稳定可能在生物样本任何环节中发生，如采集、储存、提取、分析等，这会导致分析物或其代谢产物的检测数据出现偏低或偏高的现象。在方法开发阶段，应充分考察和评估分析物的稳定性。

临床前体内快速筛选的生物分析由于处于研发的早期阶段，分析物的生物学活性尚未全面了解，可从生物因素和化学因素这两方面对其不稳定问题进行探究。生物因素主要包括生物基质中酶类型及其活性、抗凝剂和蛋白浓度等。化学因素主要包括分析物活性基团、氧化反应、分析物同分异构体之间的相互转化以及分析物与代谢产物之间的转化等。其他因素，如光照、温度、pH和时间等也会影响分析物的稳定性。本文将主要从生物因素中的酶类型及其活性和化学因素中的分析物活性基团两个方面进行探讨。

酶

分析物通过化学结构改变（水解、肟化、脱氢、氢化、结合等）在体内代谢，大多数体内代谢都需要酶的参与。部分酶在离体基质中具有活性，是分析物或前体分析物离体降解的主要原因。以酯酶为例，它是水解分析物中各类酯键的重要参与酶。酯键在酯酶的作用下会水解断裂，如乙酰胆碱在酯酶的作用下会水解生成乙酸和胆碱（图1）。离体基质中的其他类型酶，如脱氨酶和蛋白酶等也可能导致分析物的离体降解。在不同物种间的生物基质中，酶的表达和活性也存在很大差异。例如，啮齿类基质中的酯酶活性远大于非啮齿类基质中的酯酶活性^[1]，因此在啮齿类动物样品中更容易出现不稳定现象，需要在方法开发阶段更加关注。

图1. 酯酶介导的酯键水解

酶引起不稳定问题的解决思路：

（1）使用特定的酶抑制剂

特定的酶抑制剂能够特异性地作用于酶的某些活性中心或必需基团，从而降低酶活性甚至使其完全失活，有效地干预酶解反应的发生。

对于羧酸酯酶或磷酸酯酶，常见的抑制剂包括苯甲基磺酰氟（PMSF）、敌敌畏（DDVP）、双硝基苯基磷酸酯（BNPP）等。此外，PMSF和DDVP也是胆碱酯酶的抑制剂。氟磷酸二异丙酯（DFP）、PMSF以及抗凝剂肝素的联合使用可以有效抑制丝氨酸蛋白酶活性。四氢尿嘧啶则可以抑制胞嘧啶脱氨酶活性。

EDTA和草酸钾不仅可以与血液中的Ca²⁺离子结合成螯合物，起到中断凝血过程的效果，同时还可以与Mg²⁺、Mn²⁺和Fe²⁺螯合，抑制一些需要金属离子激活的核酸酶和蛋白酶的活性。此外，氟化钠作为抗凝剂的同时也是一种非特异性酯酶抑制剂^[1]。

酶催化降解引起分析物在基质中不稳定的机理和过程非常复杂，在不同种属的基质中呈现的酶敏感度也不同，因此需要选取合适的酶抑制剂。表1归纳总结了离体基质中常见类型的酶以及对应的抑制剂种类。如果分析物同时受到多种酶的作用影响，仅引入一种酶抑制剂可能无法达到理想的稳定效果，建议联合使用多个酶抑制剂。

表1. 离体基质中的常见酶及相应的酶抑制剂

（2）干血斑（DBS）法

干血斑（DBS）法是通过采集全血滴在纤维素卡片，在室温下干燥形成血斑后进行检测。在干血斑制备过程中，会破坏酶蛋白的三维结构，从而使其失去活性。DBS法不但能解决分析物在全血中不稳定的问题，还能明显降低分析所需血液样本体积，简化了样本采集和储存过程。但该方法仅适用于全血，因此在使用其他基质进行检测时具有局限性。

（3）控制pH

pH对酶活性有很大影响，它改变了酶活性部位相关基团的解离状态。在最适pH时，酶活性基团的解离状态最适合与底物的结合。而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团的解离状态则不利于酶与底物的结合，导致酶活性降低。另外，pH对酶的稳定性也有很大影响，过高或过低的pH均会改变酶的活性中心的构象，甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。

活性基因

分析物的化学结构可能存在一些不稳定的活性基团（图2），因其特定环境的影响，这些活性基团在离体基质中会发生结构变化，从而影响测定的准确性。

图2. 分析物结构中的不稳定活性基团

（1）含巯基或者类似巯基的分析物，容易与自身的或氨基酸、多肽、蛋白质中的巯基形成二硫键，导致检测结果出现偏差。例如，半胱氨酸的巯基在离体基质中会与自身结合形成胱氨酸（图3）。

图3. 半胱氨酸在基质中发生巯基结合反应

三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)可以解决巯基引起的不稳定问题，它们可以抑制二硫键的生成，并断裂二硫键，将其还原成相应的原分析物（图4）。

图4. TCEP参与巯基还原反应

在样本采集时，可以对不稳定的分析物进行衍生化反应，不稳定的分析物通过与衍生化试剂反应，生成稳定的衍生化产物，通过对衍生化产物的定量分析可以间接测定原分析物（图5）^[2]。含有巯基的分析物一般不稳定，则可以通过衍生化的方式生成稳定的半胱氨酸类似物。

图5. 通过衍生化生成稳定的间接分析物

（2）在溶液和生物样品中，含有羰基、硝基芳香结构、N-氧化物、C=C双键和芳基氯化物基团的分析物对光不稳定且易氧化。在分析过程中通常会避光操作，同时在生物样本、提取溶液或复溶液中加入抗氧化剂，如维生素C、焦亚硫酸钠或盐酸等。或通过与柠檬酸钠、谷胱甘肽、肝素或EDTA等其他试剂联用的方式起到稳定作用（图6）。

图6. 不稳定且易氧化的分析物的处理办法

（3）含有Z/E异构、手性和易形成内酯基团的分析物，其样本在储存、解冻、提取、样本提取物干燥、复溶和MS检测期间，在中性或者合适的pH环境下可发生Z/E异构化、手性转化和内酯化，从而导致检测浓度偏离实际浓度值^[3]。这些不稳定与pH或者该种基质内含有的特定物质有关，尤其在排泄与组织匀浆样品中较易发生。

甲酸、乙酸、盐酸、磷酸、柠檬酸以及各种缓冲液的加入可以使pH偏离不稳定窗口，不再发生结构变化，从而使分析物稳定。但在调节pH时，也需避免极端酸碱出现，以防其他不稳定情况发生。

（4）含N-氧化物、S-氧化物、葡糖苷酸或硫酸盐分析物，在LC-MS/MS分析检测中，部分分析物在ESI或APCI源中会发生裂解或转化。具有弱化学键的分子在进入串联质谱仪的Q1室之前，在电离过程中也易破碎。

更换离子源类型或者调整MS参数可以有效减少原分析物及其代谢产物发生源内裂解的情况。N-氧化代谢产物对热不稳定，在较高的离子源温度下极易转化为原分析物，因此使用ESI源相对APCI源可以有效减少N-氧化的转化^[4]。

总结以上分析物不稳定的解决策略，在生物分析中可以采取以下措施预防不稳定情况的发生（图7）：

图7. 不稳定问题的预防措施

结语

稳定性条件是生物分析开发中必须评估和控制的，了解影响稳定性的成因对于开发过程中选择有效的解决途径至关重要。在方法开发和验证的早期阶段，使用真实样品考察不稳定分析物的短期稳定性可以帮助发现“隐藏”的不稳定问题。不稳定问题发生的确切原因各异，相关的解决方法在不同分析物、不同种属、不同基质之间存在一定的差异，需要根据实际情况分别进行考察。目前生物分析中遇到的PROTAC、PDC、多肽、手性和核酸类等分析物在基质中都可能存在潜在的不稳定性，因此在方法开发过程中尤其需要关注并考察其稳定性。

作者：陈丹，何玟辉，高峥贞，卢金莲，张玲玲，邢丽丽

编辑：钱卉娟，袁萌

设计：倪德伟，张莹莹

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