ADC有效载荷（Payload）的发展及其药代动力学考量

化疗药物是肿瘤治疗的重要手段。目前已经开发了基于不同机理的化疗药物，可以作用于上游核苷酸合成所需的嘌呤和嘧啶等初始原料，以及DNA复制所需的脱氧核苷酸或RNA转录所需的核糖核苷酸，或者直接作用于“中心法则”的DNA、RNA和蛋白。微管蛋白作为细胞骨架的重要组成部分，参与了许多对细胞功能至关重要的细胞过程，如细胞迁移和有丝分裂等。作为经典的抗癌药物，紫杉醇作为微管蛋白稳定剂，而长春花碱作为微管的去稳定剂。

图 1. 常用化疗药物作用机制

为了增强化疗药物的靶向性，从20世纪50年代后期开始，研究者们相继开展了由鼠源抗体与化疗药物如阿霉素，长春花生物碱和甲氨蝶呤等组成的偶联物进行临床前研究及临床研究，很大程度上促进了ADC药物的研发探索^[1]。可以说，ADC脱胎于化疗药物。然而，所谓的“第一代ADC”并不成功，主要原因在于“第一代ADC”靶向性较差，且化疗药物本身的活性不够强，导致疗效不够理想但毒性并不低；一些高毒性的化合物由于毒性太大不能作为药物单独使用，但却可能作为ADC药物的有效载荷（Payload）。随着ADC药物临床上逐渐成功，同时ADC药物和免疫检查点抑制剂联合用药大有取代化疗药物和免疫检查点抑制剂联合用药的趋势^[2]，ADC药物必将青出于蓝而胜于蓝。

一、高效的细胞毒药物

目前获批上市的ADC药物的有效载荷都具有高毒性，主要包括MMAE/MMAF、卡奇霉素、DM1/DM4、SN38/Dxd等，这些有效载荷的毒性比化疗药物要高1-2个数量级，有的毒性甚至达到了pM级别（见图2）^[3]。目前开发的有效载荷作用机制主要限于DNA烷化剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白破坏剂和RNApolII抑制剂。表1总结了ADC有效载荷的作用机制、是否有旁观者效应、有效载荷引起的相关毒性^[4]等。然而，高效的细胞毒药物并不多，因此，迫切需要开发高效毒性且有不同作用机制的细胞毒性药物。针对目前已上市ADC的有效载荷已经有比较多的介绍^[5]，而本文将就新开发的、上市ADC中没有应用到的非传统有效载荷做一个简要介绍，包括杜卡霉素、PNU-159682、鹅膏覃碱、Tubulysins和艾日布林。

表1. ADC有效载荷作用机制、旁观者效应、相关毒性及药物例子^[5]

* DM1本身透膜性不差，在Kadcyla中DM1与不可裂解的连接子相连，解离出的DM1带有部分连接子而带负电，透膜性变差而导致Kadcyla没有旁观者效应。

图2. 常见细胞毒药物的IC₅₀范围^[3]

杜卡霉素

杜卡霉素是DNA烷化剂，可以作用于肿瘤细胞的全周期，体外活性达到pmol级别。杜卡霉素透膜性较好，具有“旁观者效应”，且对于含有多药耐药外排的细胞系均保持活性。

SYD985是Byondis开发的靶向HER2的ADC^[6]，由曲妥珠单抗通过可裂解的连接子与杜卡霉素相连，DAR值为2.8。SYD985经组织蛋白酶B裂解后，游离苯酚促进分子内重排成亲电环丙基形式，环丙烷易与DNA共价结合而导致DNA烷基化。SYD985的主要安全问题包括眼毒性和间质性肺炎（ILD）。

图3. SYD985结构及体内裂解释放出DUBA示意图

PNU-159682

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的恶性骨肿瘤，约有40~50%患者术后可复发或发生远处转移，导致5年生存率低于30%。蒽环类药物如阿霉素（doxorubicin）是目前骨肉瘤的一线化疗药物之一，能插入DNA双螺旋中，阻止双链分离，影响DNA复制和RNA合成。阿霉素作为ADC有效载荷由于细胞毒性不够（doxorubicin的IC₅₀见图2），开发了另一种细胞毒性比阿霉素高100倍的蒽环类药物PNU-159682。PNU-159682是奈莫柔比星（Nemorubicin）的肝脏代谢物，可抑制DNA拓扑异构酶II，其效力比奈莫柔比星高三个数量级，IC₅₀为20–100 pM，同时PNU-159682也不是外排转运蛋白的底物^[5d]。

图4. 奈莫柔比星（Nemorubicin）在肝脏中转化成PNU-159682（勘误：图中数个位点碳原子应为氧原子）

Genentech基于PNU-159682开发了一种新的抗CD22-NMS249 的ADC药物，使用MC-VC-PAB-DEA连接子，DAR值为2 （图5）。这种抗CD22-NMS249 ADC在异种移植肿瘤模型中至少与抗CD22-VC-MMAE ADC一样有效，但对CD22-VC-MMAE ADC产生耐药的细胞系的模型中仍然有效^[4]。目前开展的临床实验暂未披露PNU-159682相关的毒性。

图5. anti-CD22-NMS249 ADC结构

鹅膏覃碱

鹅膏覃碱（amanitin）家族由九种结构相似的毒素组成，来源于全球毒性最大的蘑菇鹅膏菌，其中α-amanitin和β-amanitin是两个最主要的毒素，是由8个氨基酸组成的双环肽。误食鹅膏菌会出现呕吐、癫痫和严重的肝损伤（amanitin是肝脏转运蛋白OATP1B3的底物），并由此导致了90%的蘑菇相关死亡案例。Amanitin是一种高效的RNApolII抑制剂，细胞毒性范围在pM级，可以高效结合真核生物的RNA聚合酶Ⅱ从而降低RNA转录和蛋白合成效率超1000倍。因此amanitin不仅可以杀死处于分裂阶段的肿瘤细胞，也可以杀死处于休眠阶段的细胞，包括肿瘤干细胞。由于毒性太大，不能作为抗癌剂进一步开发，但作为一种潜在的ADC有效载荷呈现出许多优点，如高毒性、亲水性、非P糖蛋白（P-gp）的底物等。

HDP-101是Heidelberg Pharma开发的靶向BCMA的ADC药物，由BCMA抗体、VA-PABC连接子和Amanitin衍生物HDP 30.2115组成。由于高毒性，DAR值为2，并且采用定点偶联的方式保证均一，以降低可能潜在的毒性^[7]。2021年5月，HDP-101进入早期临床试验用于治疗多发性骨髓瘤 (NCT04879043)。HDP-101最近被发现是一种免疫激活药物，可以诱导免疫原性细胞死亡(ICD)，并与免疫检查点抑制剂表现出协同作用，这为临床联合用药提供了可能性。

图6. α-amanitin和β-amanitin及HDP-101结构

Tubulysins

Tubulysin类天然产物是从粘细菌种分离出来的抑制微管聚合的毒性四肽。该类天然产物的细胞毒性是长春碱、紫杉醇的10-1000倍以上（IC₅₀在皮摩尔范围内），通过抑制微管聚合将细胞阻滞在G2/M期。并且Tubulysin不是多药耐药外排转运蛋白的底物。药物研发人员一直致力于研究Tubulysin类天然产物的结构-活性关系（SAR），期望能将该类分子作为有效载荷用于新型ADC的开发。

图7. Tubulysins类家族及MEDI4276结构

AstraZeneca/MedImmune开发了一种双特异性 ADC MEDI4276^[8]，靶向 HER2的两个不同表位，双特异性可能会增加内化，从而增加有效载荷释放和增强对癌细胞的杀伤。MEDI4276由双特异性抗体与Tubulysin衍生物AZ13599185通过不可切割的连接子连接，DAR值为4。MEDI4276在临床前研究中表现出了良好的抗肿瘤活性，临床研究的主要毒性是肝毒性。 

艾日布林

艾日布林（Eribulin）是从海绵中分离出的大环软海绵素b（Halichondrin b）的合成类似物。艾日布林选择性地与β-微管蛋白（+）端结合，抑制微管的伸长，但对微管的解聚几乎没有影响，因此艾日布林对紫杉醇耐药后的患者依然有效。2010年11月，艾日布林被美国FDA批准用于治疗转移性乳腺癌。以艾日布林作为细胞毒素的抗体偶联药物ADC具有较强的“旁观者效应”，因而具有较好的临床效果，并且艾日布林对P糖蛋白（P-gp）不太敏感。

卫材研发的靶向FRα的ADC药物MORAb-202使用了艾日布林作为毒素（图8）。抗体部分是抗叶酸受体α的人源化单克隆抗体Farletuzumab，通过酶可裂解型连接子与艾日布林结合，DAR值为4。同为靶向FRα的ADC中进度最快的是ImmunoGen开发的mirvetuximab soravtansine，其在III期临床试验（FORWARD I，n=336）中总缓解率（ORR）为22%，而MORAb-202在I期临床试验（NCT03386942，n=22）中ORR达到45.5%，并且展现出良好的耐受性，展现出同类最佳潜力，主要相关的毒性是1/2级间质性肺炎。

图8. MORAb-202结构

二、有效载荷的体外和体内药代动力学研究考量

结合《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则（征求意见稿）》，以及药明康德 DMPK的研究经验，对于新的有效载荷，推荐开展相关体外和体内药代动力学研究。

血浆蛋白结合研究

ADC给药后体内血浆中有效载荷浓度一般较低，血浆蛋白结合的考察理应考察较低有效载荷浓度范围。但是由于检测灵敏度限制，常规质谱分析方法无法检测时，可选择采用放射性标记的有效载荷进行血浆蛋白结合率考察。

组织分布和排泄/物质平衡

同样由于检测灵敏度限制，采用常规质谱方法进行组织分布和排泄研究存在很大挑战。采用非放射性标记有效载荷来研究，很难保证得到较高的排泄回收率，无法明确有效载荷排泄途径，以及得到高毒性的有效载荷是否能够顺利从体内排出这一重要信息。因此针对有效载荷，通常建议采用放射性标记的方法来追踪小分子化合物在体内的ADME特征。对于组织分布研究，我们推荐采用定量整体放射性自显影（QWBA）来进行研究，QWBA可更细节地显示有效载荷在各组织中分布，尤其是一些组织摘取法很难区分的皮肤、眼部等组织。

体外和体内代谢研究

从代谢稳定性角度，理想的有效载荷一旦进入到循环系统中，需要被快速代谢，从而降低系统暴露和系统毒性。了解有效载荷代谢是否存在种属差异是必要的，毒性相关动物种属选择需要参考有效载荷代谢特征，选择与人相关的种属进行毒理学考察。此外也建议采用毒代动力学（TK）实验中采集的血浆进行有效载荷相关的代谢产物鉴定研究，并与人体内ADC给药后血浆中有效载荷相关代谢产物鉴定结果进行对比，从而评估毒理种属中有效载荷相关代谢物的暴露能否覆盖人种属。

对代谢酶影响研究

该评价包含有效载荷是否对药物代谢酶存在抑制或诱导，以及鉴定参与有效载荷代谢的药物代谢酶亚型。理论上，有效载荷体内血药浓度低，作为代谢酶抑制剂或诱导剂的风险较低。同样由于有效载荷体内血药浓度低，如果已知有效载荷是某代谢酶底物，对该酶的抑制可能显著升高有效载荷体内血药浓度，从而增加毒性反应。因此，在临床前研究阶段，有效载荷代谢酶表型研究至关重要。

对转运体影响研究

该评价包含有效载荷是否为转运体底物或转运体抑制剂。由于有效载荷在体内浓度一般较低，理论上来讲，有效载荷作为转运体抑制剂的风险较低。转运体摄取或外排作用，影响药物在体内的分布和排泄。有效载荷如果是摄取或外排转运体底物，可影响有效载荷在某些转运体高表达组织的分布，增加对特定组织的毒性风险。肿瘤组织一般过表达Pgp、 BCRP或MRPs等外排转运相关蛋白，假如有效载荷是Pgp 、BCRP或MRPs的底物，由于外排转运体的作用将减少有效载荷在肿瘤组织中蓄积从而影响疗效以及产生耐药。

PK/PD研究

虽然ADC的抗体部分可能与免疫效应细胞发生相互作用，包括CDC (补体依赖细胞毒性)、ADCC（抗体依赖性细胞毒性）和ADCP（抗体依赖性细胞吞噬作用）效应，但ADC的药效发挥主要来自于有效载荷。Zhang等^{[9, 10]}比较了以PBD为有效载荷的不同ADC在肿瘤小鼠上的药效，抗肿瘤效应与肿瘤内有效载荷的暴露量直接相关，同时，随着时间的推移，由于靶标（DNA）对有效载荷的响应饱和，抗肿瘤效应趋于平稳。以MMAE为有效载荷的ADC在荷瘤小鼠药效模型上也有类似的现象。该研究提示，ADC的抗肿瘤药效不是与ADC的系统暴露量相关，也不是与血浆中有效载荷的暴露量相关，而是与肿瘤中有效载荷的暴露量直接相关。鉴于此，有必要开展模型动物中肿瘤组织的PK研究以评估ADC药物的PK/PD。

图9. 动物模型肿瘤组织中的药物浓度和抑瘤效果的关系^[9]

总结与展望 

理想的ADC的有效载荷性质包括：

• 独特的作用机制，与目前常用化疗药物机制不同，能有效避免交叉耐药；

• 对肿瘤细胞杀伤力足够强，能达到pM级别；

• 有与连接子连接的合适位点；

• 具备一定的水溶性，能促进ADC的偶联；

• 血液循环系统中快速消除，降低系统毒性；

• 非外排转运蛋白的底物以避免耐药；

• 最好能有“旁观者效应”，杀伤异质性肿瘤。

本文就新开发的、上市ADC中没有应用到的非传统有效载荷做了相应的介绍。针对有效载荷的开发，除了对各种类型的细胞毒素进行不断的筛选优化和改进，也出现了双弹头的有效载荷^[11a]，以及不同作用机制的有效载荷如核素、糖皮质激素等抗炎药物^[11b]、PROTAC^[11c]、RNA等。ADC药物的适应症也从肿瘤向感染、自身免疫疾病等不同疾病领域扩展。

作者：程起干，马利萍，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

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