多肽药物代谢产物鉴定研究的挑战和策略

多肽药物广泛应用于治疗多种疾病，主要治疗领域有罕见病、肿瘤、糖尿病、胃肠道、骨科、免疫和心血管疾病等。截至目前，已有近100种多肽药物获批上市；在某些小分子药物或治疗性抗体难以治疗的疾病方面，多肽药物也发挥着重要作用^[1]。

虽然多肽药物在众多疾病治疗领域中发挥着重要作用，但因多肽化合物的化学与生理稳定性相对较差，易被蛋白水解酶降解，造成多肽化合物口服生物利用度低、代谢快和半衰期短等问题。因此通常会采用环化或双环化、N-或C-端修饰、将L型氨基酸替换为D型氨基酸或非天然氨基酸以及增大分子量等方式对多肽结构进行优化，来提高其代谢稳定性^[2]。

当多肽结构中引入非天然氨基酸和/或有机连接基团时，需进行代谢产物鉴定研究，以评价循环系统中主要代谢产物和潜在活性代谢产物^[3]。同时，代谢产物鉴定结果不仅可以辅助识别多肽药物的代谢软点，为多肽药物的结构优化提供指导意见^[4] ；也可用于比较多肽在不同种属中的代谢差异，为毒理种属选择提供参考；还可阐明多肽药物的清除途径和支持新药申报。

本文将主要介绍多肽药物代谢产物鉴定研究的实验体系、挑战和应对策略，并以GLP-1受体激动剂索马鲁肽为例，结合药明康德DMPK部门对索马鲁肽的代谢研究经验，来阐述其代谢产物鉴定的方法及其体外和体内代谢产物的相关性。

一、多肽药物的代谢特征及其实验体系

多肽药物主要通过肽酶水解，肽酶可分为外肽酶和内肽酶。这些酶在机体内广泛分布，包括肝、肾、胃肠道、肺、血液、血管内皮、皮肤及其它组织和器官，它们具有不同的作用机制。内肽酶可切割多肽链中的肽键，多肽首先被内肽酶水解为寡肽，产生的寡肽再通过外肽酶（氨基肽酶或羧肽酶）从肽的N端或C端进一步水解为氨基酸。多肽药物的分子量大小和结构不同可能导致其对应的代谢酶及代谢机制有所不同^[5]。

多肽药物常见的给药方式有皮下注射、静脉注射、口服、鼻腔给药等，无论多肽是以何种方式给药，都需要进行血浆/全血中多肽的代谢研究。当多肽化合物拟开发为口服和/或肠道受限药物时，除了常规血浆/全血的代谢研究外，首先推荐使用人工模拟肠液进行体外实验^[6]，因为小肠液似乎是多肽的主要代谢屏障，这可能是由于胰腺肽酶的底物广谱特异性，较高的酶活性等导致。其次，在人肠道上皮细胞的体外研究结果表明，多肽也易受肠细胞中富含的水解酶、还原酶和氧化酶影响。基于以上因素，人工模拟肠液和肠上皮细胞体系都可以用来考察多肽化合物在胃肠道中的代谢情况。

多肽药物最重要的代谢器官是肾和肝，主要通过尿液和粪便途径排泄^[2]。有文献资料显示：

分子量大于1000 Da 的多肽

肾脏是主要的代谢部位^[5]。分子量较小的多肽经肾小球过滤后，被近端小管刷状缘膜上的外肽酶水解为氨基酸；分子量较大的多肽会经肾小球过滤后，通过内吞作用和溶酶体水解成氨基酸。肾S9和肾匀浆是肾脏体系中较为合适的体外实验体系。

分子量小于1000 Da 的多肽

特别是环肽，肝脏往往是主要的代谢部位^[6]；而且部分多肽药物的代谢有CYP酶依赖性，如环孢菌素的代谢依赖于细胞色素P450（CYP3A4），它通过各种代谢途径形成30多种代谢物^[7]。因肝细胞所含的酶种类最为丰富，因此肝细胞可作为体外肝代谢研究体系。由于多肽药物在肝细胞中的代谢主要是通过载体介导的跨膜转运体或内吞和胞饮作用进行，该情况下，孵育时间需要适当延长。另外，部分多肽难以进入肝细胞，导致无法研究体外肝细胞中的代谢产物^[8] ，可以选择在肝S9的体系中添加Ⅰ相和Ⅱ相代谢辅因子来模拟肝细胞体系。

综上，常用的多肽体外代谢体系主要有血浆/全血、人工模拟肠液/人工模拟胃液、肠上皮细胞、肾匀浆/肾S9、肝细胞/肝S9等。除此之外，针对体内代谢研究，也可以采用动物给药后的血浆、尿液、粪便、靶向组织（肝或肾等）样品来研究多肽药物的代谢情况。基于文献资料和药明康德药性评价部多年的多肽项目经验，对不同研究阶段或是不同给药途径的多肽药物，汇总了建议开展的体内外代谢产物分析与鉴定研究体系，如图1。

图1. 常规给药和口服给药的代谢产物研究实验体系

二、多肽代谢物鉴定的分析难点和策略

多肽药物从结构来讲，通常可分为仅有天然氨基酸组成的线性肽、含有非天然氨基酸结构的线性肽和环肽。环肽因其成环的键不同，可分为仅有酰胺键成环的均环肽和至少含有一个非酰胺键成环（如二硫键和硫醚键等）的杂环肽。多肽通常由10-40个氨基酸组成，分子量介于小分子和生物大分子之间，具有在质谱中容易形成多电荷离子和紫外吸收比较弱等特点。相较于常规小分子药物，多肽药物的代谢产物鉴定具有如下几个挑战：

1. 在体外代谢研究中，多肽的代谢途径相对比较单一，主要为水解，但多肽的水解位点多；除了水解外，部分多肽还可能经CYP酶代谢，发生Ⅰ相代谢反应。在体内研究中，多肽药物的代谢途径会相对复杂，往往存在多种代谢酶的共同作用，代谢广泛，产生较多的代谢产物，如linaclotide给药后的动物体内基质中产生了几十个代谢产物^[9]，如何全面和准确地鉴定出所有代谢产物是有一定难度的。

2. 多肽分子生理活性强，其给药剂量一般较小，体内药物和代谢产物的浓度较低；同时，大部分多肽的特征紫外吸收较弱。在没有同位素标记的情况下，只能通过与空白基质进行对比分析（背景扣除）。因此，这不仅对代谢产物鉴定技术能力是个挑战，对质谱的分辨率和灵敏度也是巨大的挑战。

3. 由于代谢产物鉴定的大部分数据处理软件难以识别非二硫键、非酰胺基连接成环的环肽结构，导致多肽的代谢产物分析很难通过软件进行数据处理，需要靠人工处理数据，工作量较大。尽管少数软件可以用于辅导发现和鉴定多肽的代谢产物，但其在数据处理时可能出现遗漏代谢产物，或多电荷识别错误导致无法准确发现代谢产物等问题。

4. 因多肽化合物的紫外特征吸收一般较弱，难以用紫外峰面积对原型药物和代谢产物进行半定量分析（计算相对丰度），多数情况下，只能采用质谱峰面积进行半定量分析，但该方法往往又存在较大误差，主要原因如下：（1）母药和其代谢产物的离子化效率不同，导致质谱峰面积占比与其真实相对含量差异大；（2）多肽化合物往往会产生多电荷离子，如何选取合适的价态离子，是选择多电荷离子的单同位素峰，还是丰度最高的峰，又或是多个价态下所有离子的质谱峰面积合并处理？因此在多肽药物代谢产物鉴定研究中的产物半定量分析和数据解读时，都需要综合考虑这些因素，方能更好地为多肽药物开发提供助力。

为了更全面和准确的鉴定多肽的代谢产物，药明康德DMPK建立了用于发现和鉴定多肽的液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析平台，结合多样化的数据处理软件（Compound Discoverer，BioPharma Finder，UNIFI® 和Mass-MetaSite等）和数据处理技术（背景扣除、质量亏损过滤和特征离子提取等），采用靶向和非靶向分析技术，软件与人工相结合，以快速和全面地发现多肽在体外和体内实验体系中的代谢产物。

图2.多肽代谢产物鉴定的高分辨质谱分析方法和数据处理流程

三、案例分享

索马鲁肽（Semaglutide）是FDA批准的首个口服GLP-1受体激动剂，主要用于治疗2型糖尿病。目前未见索马鲁肽在体外肾S9实验体系中代谢产物研究的文献报道，故本文以小鼠、大鼠、猴和人体外肾S9为实验体系，来研究索马鲁肽的代谢情况，并介绍索马鲁肽在肾S9中代谢产物鉴定方法、代谢产物研究结果和体内的代谢相关性分析。

本案例中，我们将索马鲁肽在小鼠、大鼠、猴和人的肾S9中分别孵育4小时和24小时后，有机溶剂终止反应，样品经离心、氮气吹干浓缩和合适溶剂复溶，用上述建立的LC-UV-HRMS分析方法和数据处理流程来发现和鉴定索马鲁肽在肾S9中的代谢产物。

下文将以小鼠S9中的代谢产物分析过程为例进行说明。索马鲁肽在小鼠肾S9中孵育24小时后，仅通过其LC-UV（图3A）和LC-MS（图3B）图，只能识别出代谢产物M18和原型药物索马鲁肽。

图3. 索马鲁肽在小鼠肾S9中孵育24小时后样品的LC-UV（240-300 nm）（A）和LC-MS图（B）

将孵育后样品的LC-MS图进行背景扣除技术处理后，检测到9个代谢产物，其LC-MS图见图4A；通过特征离子（m/z 334.1501，N端3个氨基酸（H-Aib-E ）残基片端）提取，在孵育后样品中，检测到10个代谢产物，其LC-MS提取离子流图见图4B；通过代谢产物数据处理软件处理后，检测到15个代谢产物，其LC-MS提取离子流图见图4C。

图4. 索马鲁肽在小鼠肾S9中孵育24小时后的样品LC-MS图，背景扣除后的LC-MS图（A）、特征碎片提取离子流图（B）和数据处理软件计算产物的LC-MS提取离子流图（C）

上述数据处理方法各有优势和不足，往往难以通过一个方法筛选出所有代谢产物，因此可以用多个方法进行筛选，然后进行数据比对和整合，以便更全面和更准确的鉴定多肽药物的代谢产物。

通过采用靶向和非靶向分析技术，软件与人工相结合，在小鼠、大鼠、猴和人肾S9中孵育4h和24h后，共检测到索马鲁肽的23个代谢产物。各代谢产物的丰度信息见表1。

备注：ND：未检测到

表1. 肾S9中孵育4小时和24小时后索马鲁肽及其代谢产物相对丰度

通过与原型药物比对，依据各代谢产物的一级和二级质谱信号，对23个代谢产物的结构进行了鉴定，索马鲁肽在肾S9中可能的代谢途径见图5。

图5.索马鲁肽在肾S9中可能的代谢途径

通过上述实验结果，在人肾S9中检测到的23个代谢产物均能在3个动物种属（小鼠、大鼠和食蟹猴）中检测到，说明索马鲁肽在各种属肾S9中代谢物谱无明显的种属差异。其中M18为主要代谢产物，代谢途径为26位赖氨酸和25位丙氨酸，27位谷氨酸之间发生水解；且随着孵育时间的增加，M18的相对丰度也随之增加。以人种属为例，在孵育4小时的人肾S9中，M18的相对丰度为~15%，孵育24小时后，相对丰度上升至~70%。

据文献报道^[10]，索马鲁肽主要通过DPP-4蛋白及中性肽链内切酶的水解和脂肪酸二酸侧链的氧化代谢，其代谢产物主要通过粪便及尿液排出。尿液中的主要代谢产物U6和U7的代谢途径为内切酶的水解和脂肪酸二酸侧链的氧化，即在代谢产物M18的基础上进一步发生脂肪酸二酸侧链的氧化。索马鲁肽在已报道的临床人体内血浆中的主要代谢产物P3B也能在肾S9体系中检测到（M19）。结果表明，索马鲁肽在人体内的主要代谢产物或相关的代谢产物均能在体外S9体系中检测到，体外肾S9体系中的代谢结果和体内的代谢结果具有较好的一致性。

 结语  

虽然多肽药物主要代谢途径为水解，但因多肽的结构特点和代谢特征，多肽代谢产物分析和鉴定比小分子更具有挑战性。多肽的代谢产物鉴定结果不仅能够帮助多肽的结构优化和支持毒理种属的选择，还能够阐释多肽药物的清除途径和支持代谢产物潜在安全性评估，因此代谢产物鉴定研究是多肽类药物研发时不可或缺的一环，尤其是对结构中含有非天然氨基酸和/或有机连接基团的多肽药物。基于此，药明康德DMPK部门建立的多肽代谢及代谢产物分析鉴定研究平台，以UPLC-UV-HRMS技术为核心，通过多种数据处理软件辅助代谢产物分析及鉴定，为客户提供高质量的代谢和代谢产物分析鉴定研究，助力客户的多肽药物研发快速推进。

作者：杨蓉，李瑞兴，曹卫群

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

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