基于LC-MS技术的抗体偶联药物（ADC）药代动力学生物分析策略

ADC药物结合了单克隆抗体的高度靶向性和小分子毒素的强细胞毒性，被誉为“精确制导的生物导弹”。 ADC类药物结构复杂且形式多样，使得ADC的药代动力学研究极具挑战性和不确定性。然而忽视ADC的PK研究，或仅用毒理数据代替，可能带来严重的潜在后果。在PK研究中，生物分析作为对各个阶段结果抽丝剥茧的具象化呈现过程，具有不可或缺的作用。本文将从完整ADC的药物-抗体比（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）分析，各ADC组分的药代动力学研究方法展开，结合丰富的团队经验，为大家分享ADC药代动力学生物分析策略。

图1. ADC的分子结构示意图

一、ADC药代动力学生物分析总体策略

ADC药物兼具小分子和大分子治疗药物的分子特征，因此用于小分子和大分子两种药物的典型分子的生物分析方法都是其必要的分析手段。具体来说，ADC药物的生物分析策略一般可以分成三个方面，这三个方面的生物分析策略贯穿于ADC类药物的临床前发现，临床前开发与临床开发阶段：

动物血浆/血清中ADC的DAR值测定

不同DAR值的ADC可能具有完全不同药代动力学和毒理特征，甚至可以视为两种药物。仅粗略的将ADC作为混合物进行平均研究，可能会导致临床前实验结果不准确，或产生不可预知的毒性。因此，准确的ADC DAR值测定十分有必要。我们开发了新的方法来表征血浆/血清中ADC药物的分子结构以确定循环中不同DAR值的分析物，这种方法提供了ADCs体外/体内过程的数据，例如，随着时间的推移，抗体是否仍然携带大部分共价结合的药物。

ADC相关成分的定量分析

根据其自身结构和体内转化的特点，在进行药代动力学分析时，通常将ADC的分析物分为全抗体（Total antibody）、ADC、结合型payload、游离型payload、Payload相关产物以及ATA等五种。结合传统的大分子LBA（ligand binding assay）、小分子LC-MS/MS分析、亲和捕获LC-MS/MS，以及亲和捕获LC-HRMS等新的分析方法，开发出可行的定量分析方法，对动物血浆/血清中的ADC成分进行定量分析，如表1所示。其中 LC-MS法具有时间周期短，通用性好的优点，目前已越来越多的被用于大分子定量分析。本文将集中围绕LC-MS平台分析方法，结合案例进行详细阐述；

表1. ADC成分定义与其对应的分析方法

ADC药物的ATA考察

ADC药物的ATA (anti-therapeutic antibody)需要开发合适的方法来测定。这一部分目前主要由LBA平台完成，药明康德DMPK有专门的LBA方法平台，后面我们将就此发布专题文章，本文不再涉及。

二、ADC DAR值表征

2.1 DAR是什么？

DAR（Drug to antibody ratio，单个抗体分子携带的药物分子个数，即药物-抗体比）是描述ADC药物理化性质的重要参数，表示单个ADC分子携带的毒性小分子的载量，影响着ADC药物的安全性和有效性。目前获批的ADC大多采用异质化连接技术，即基于抗体表面的赖氨酸残基（amine-based lysine conjugation）偶联或基于通过还原二硫键释放的半胱氨酸偶联（thiol-based cysteine conjugation）。由于每个抗体具有多个Lys/Cys位点，偶联的过程又是随机进行的，偶联形成的payload的个数与位置都不能确定，最终得到的ADCs经常是含有不同DAR值的多种成分的混合物，以T-DM1为例，如图2所示，根据质谱检测，其DAR值范围为0-7，平均DAR值约为3.5。

图2. T-DM1 DAR值表征结果。T-DM1为各个不同DAR值ADC的混合物，借助液相色谱高分辨质谱分析平台，可以实现不同DAR值ADC的表征

DAR值会影响ADC在体内循环的稳定性，通常，理想的DAR值为3-4，过高DAR值的药物清除率会增加，半衰期会逐渐降低且还可能引起药物聚集，增加药物毒性。

2.2 如何进行ADC DAR值测定？

DAR值的分析可分为两方面，一为DAR的分布，表征各个具有不同DAR值的ADC分子分别占总ADC分子的比例；二为平均DAR值，即体系中总的药物分子和抗体分子的摩尔浓度之比。药明康德DMPK 专门建立了基于LC-HRMS的完整蛋白分析能力（intact protein analysis），用于表征ADC的DAR值，此后我们也将针对完整蛋白分析能力发布专题文章，欢迎持续关注。与传统的DAR值表征方法，HIC-UV法相比，LC-MS法在大大降低样品消耗的同时，能够提供更为准确的DAR值结果^[7]。

对于生物基质中的ADC药物，一般处理流程为先利用能与目标ADC特异性结合的抗人抗体、特征抗体或者抗原对目标ADC进行亲和免疫捕获，然后利用LC-HRMS平台对纯化后的ADC进行直接分析，最后使用去卷积软件进行数据处理。获得绝对分子量不同的、具有不同DAR值的ADC分子的特异峰，完成ADC药物的DAR值分析。此外，也可对纯化后的ADC进行还原，获得单独的轻链与重链，之后再进行LC-HRMS分析，所得谱图去卷积后，可以分别获得轻链和重链的DAR值，间接地对ADC药物进行DAR值分析。

图3. ADC药物DAR值表征流程

该能力平台被用于验证ADC药物T-DM1的体外/体内稳定性，提供了具有超高灵敏度（LLOQ: 0.5-1 μg/mL），特异性和准确性的DAR值分析方法。其中体外稳定性实验结果如图4所示，完整蛋白的分析结果清晰地揭示了T-DM1的DAR值变化情况。

图4. T-DM1体外血浆稳定性检测结果。随着孵育时间的增加，高DAR值ADC（如图中DAR6即在24 h后消失）含量逐渐下降，相应地ADC的平均DAR值从T0的3.34下降至48 h后的2.21

三、ADC药物成分在血清/血浆或其它生物基质中的定量分析

在大分子定量研究领域，基于LBA平台的ELISA（酶联免疫吸附测定，即enzyme-linked immunosorbent assay）通常被视作“金标准”。然而，ELISA通常需要针对不同的基种属和基质类型进行优化，试剂与方法的通用性一般，方法开发的周期一般也较长，这些问题对于ADC的早期研发尤其突出^[3]。近年来，随着质谱技术的不断发展，LC-MS/MS和LC-HRMS技术正越来越多的被用于大分子表征和定量^[4-6]。与传统ELISA方法相比，LC-MS方法开发周期更短，方法的通用性更好；且基于高分辨质谱的LC-HRMS，在对大分子进行定量的同时，还可以对ADC类药物的DAR值进行测定，助力完善ADC的生物表征。

ADC药物在体内的存在形式常常是由生物转化，DAR值变化或这些过程的组合引起的复杂、动态变化的混合物。在这种情况下，现有的PK中关于“治疗浓度”与时间的表述不再清晰，这对ADC药物的定量分析提出了独特的挑战。如表2中所示，目前可以用于表征ADC 药物PK 特征的分析成分包括：总抗体(Total antibody，偶联和未偶联小分子毒素的抗体)、结合型抗体(ADC，至少偶联一个小分子毒素的抗体，是ADC的原型药)、 游离型药物 (Free payload)、 结合型药物（Conjugated payload）及其类似物(Payload related species，ADC裂解或被分解后形成的效应分子)^[3]。

不同分析物的PK所反映的内容和意义不同，整体上构成ADC药物在体内代谢的全貌。目前，药明康德DMPK部门已经建立完善了全方位的LC-MS平台，可用于总抗体，完整ADC药物，游离型药物和结合型药物的药代动力学分析。

3.1 总抗体的定量分析

对于ADC类药物的总抗体分析，其样品准备与分析基本与其他抗体类药物一致。通常流程可以分成三个环节。

第一步是亲和免疫捕获，借助对ADC抗体部分具有特异性结合的抗体或抗原对目标总抗进行纯化；

第二步是酶解，生成抗体的特征多肽；

最后利用LC-MS/MS进行检测定量。

细心的读者可能已经发现，总抗体的测定与DAR值分析的第一步处理基本一致，实际上唯一的区别在于使用LC-MS/MS平台测定总抗时，由于对捕获试剂的特异性要求下降，可以选择的捕获试剂除了抗人抗体，特异性抗体，抗原蛋白之外，还可以使用通用性更强，价格相对较低，特异性较差的Protein A/G以降低实验成本。药明康德DMPK已经通过大量的实际项目，针对以上类型的捕获试剂与各种类型的抗体骨架进行了大量的实验验证和优化，大大缩短了此类型项目方法开发所需的时间，可以在较快的时间完成新的方法开发和样品分析。

图5. 总抗体的LC-MS/MS定量流程

3.2 ADC的定量分析总结

根据在展开本部分的讨论之前，我们先要确定ADC的定量分析的目标分析物究竟是什么。通常有两种方法定义ADC的PK目标分析物：

1. 从抗体角度来看，可以定义为附着至少一个药物的抗体分子；

2. 从载药量的角度来看，可以定义为结合到抗体上的药物的总浓度。

从以上两种定义出发，我们可以得到两种不同的分析策略。

如果是以附着一个以上药物的抗体分子为分析物，我们可以使用类似总抗分析的方法进行分析，不同之处在于，第一步的捕获试剂必须使用抗药物抗体，从而将结合有药物的抗体分子纯化提取出来，借用LC-MS/MS的方法对此部分抗体进行定量^[4]。

如果是以结合到抗体上的药物作为分析物，如果可以通过样品处理断开连接子，释放结合的药物，则可以在捕获得到纯化全抗之后，释放结合药物，测量结合药物的浓度实现ADC的定量分析。

除了以上两种情况，近年来，伴随着定点偶联技术的不断发展^[8]，通过蛋白水解产生的“氨基酸-连接子-药物”也可以作为ADC定量的目标分析物，从而实现结合型毒性小分子的定量分析。理论上，通过对结合型毒性小分子与总抗定量结果的分析，可以间接地实现ADC药物平均DAR值的检测。

图6. ADC的定量策略：1）对于不可裂解的linker，可以通过使用anti-payload抗体捕获ADC，然后定量结合了药物的抗体分子；2）对于可裂解的linker，可以通过释放结合型的payload，定量结合到抗体上的药物总浓度。

3.3 游离型毒性小分子的LC-MS/MS定量分析

在ADC药物的生产过程中，往往需要将多余的毒性小分子尽可能去除，由于其具有超高的毒性，轻微的残留也会对ADC药物的安全性带来巨大隐患。对于体内实验，游离型毒性小分子可能来自ADC在血浆中的释放和目标组织的释放，血浆中的游离型毒性小分子对应着ADC的脱靶毒性，是ADC性能考察的重要组成部分。

ADC药物的游离小分子有巨大的潜在毒性，药明康德DMPK部门配备有OEB3等级操作等级的前处理室，能最大程度保护实验人员的安全。对于常规的payload，如MMAE、MMAF、DM1和SN-38等，只需借助简单的蛋白沉淀法，即可实现1-3000 ng/mL的定量线性范围。针对特殊payload，如果常规蛋白沉淀法无法满足定量要求，我们也有经验丰富的小分子分析专家，针对性进行LLE，SPE等小分子提取方法的优化。

结语  

药明康德DMPK的ADC分析团队针对ADC药物的生物分析，建立健全的从血浆/血清或其他生物基质中定性/半定量分析完整ADC药物的方法，能够检测体内、体外ADC的DAR值变化及可能发生的生物转化；另外，针对可以部分代表ADC药物PK特征的各类ADC组分，包括总抗体、 ADC、 游离型药物和结合型药物等，均有成熟完备的定量分析方案。其中基于高分辨质谱的完整ADC分析法更是能够在一次检测中提供包括浓度，DAR值等极为丰富的ADC药物的PK特征参数。所有的方法一起，构成了一整套完备的ADC分析策略谱图，结合DMPK的大、小动物专业团队，为客户提供一站式的ADC的药代动力学与生物分析策略，让ADC药物的代谢与药代动力学分析轻而易举。

图7．ADC相关组分的LC-MS分析策略总结图

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：程剑辉，李陟昱

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟