药物转运体介导的药物相互作用（Drug-Drug Interaction，DDI）是药代动力学评价的重要内容之一。在早期筛选阶段通过体外转运体研究，评估蛋白降解靶向嵌合体即Proteolysis-Targeting Chimeras（在上下文中简称为“PROTAC”）分子的潜在DDI风险是值得推荐的。文献报道，某PROTAC药物与瑞舒伐他汀存在药物相互作用。受试者同时服用降胆固醇药物瑞舒伐他汀和该PROTAC药物，出现AST/ALT升高，停止使用瑞舒伐他汀后症状消失，可继续治疗。究其原因，该PROTAC药物可抑制BCRP转运体，而瑞舒伐他汀是已知的BCRP转运体底物[1]。瑞舒伐他汀与BCRP抑制剂合用可能在肠道抑制其外排提高口服吸收，在肝脏抑制其胆汁排泄，从而提升瑞舒伐他汀的血药浓度引发相应的不良反应[2]。值得一提的是，根据药明康德DMPK的研究经验，PROTAC分子的体外转运体研究评价并没有我们想象的简单。模型的选择不当，可能得到错误的结果，误导DDI风险的评估。
一、首先，什么是BCRP药物转运体？
BCRP为Breast cancer resistance protein的缩写，中文全称为乳腺癌耐药蛋白，是一种重要的ATP结合盒（ABC）转运蛋白，在药物转运中发挥重要的作用。如下图所示，BCRP主要表达在小肠上皮细胞的顶侧、肝细胞的胆管侧和血脑屏障靠近血液侧，在限制BCRP底物进入肠道上皮细胞、介导药物胆汁排泄、血脑屏障等方面可产生重大的影响。临床上很多常用的治疗药物是BCRP的底物，比如他汀类的瑞舒伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀等；抗肿瘤药阿西替尼、卡那替尼、伊马替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、伊立替康、托泊替康、依托泊苷、SN-38、甲氨蝶呤等[2]。FDA最新的体外DDI研究指导原则中也阐明，BCRP是9种推荐评估的药物转运体之一[4]。
图2. 人体内主要药物转运体及表达部位[3]
二、如何评价PROTAC对BCRP的抑制？
从药代动力学评价的角度，在早期可采用体外转运体抑制试验评估该风险。根据体外抑制结果，结合体内药物浓度，预测临床的DDI风险。如有必要，在临床研究中评价临床DDI风险。体外转运体抑制试验，可以采用Caco2细胞、高表达BCRP的细胞，或者高表达BCRP的膜囊泡进行评估。其中Caco2细胞由于容易获得，是常用的评价模型。那么对于PROTAC分子而言，是否任选一种模型即可呢？根据我们的研究经验，模型选择不当可能导致错误的结论产生。下面我们将从一个研发案例，来分析如何选择适用于PROTAC分子的研究模型。
01 研发案例及问题分析
我们首先采用Caco2细胞模型评估了某PROTAC分子对BCRP的抑制作用，BCRP抑制试验示意图如下所示，在含有抑制剂的情况下，BCRP对底物的外排会受到抑制。实验结果显示PROTAC分子对BCRP无抑制风险，但是已知该PROTAC分子对BCRP有抑制作用，初步的研究结果和文献报道不相符。在排除了溶解度差等可能的影响因素之后，我们通过采用不同的体外转运体抑制模型重新进行评估，从而得出更合理的结论。
图3. BCRP外排转运及转运抑制作用
文献报道，BCRP抑制的分子机制尚未完全了解，但可能是多种多样的。a) 有一类抑制剂如FTC和Ko143可抑制BCRP的ATP酶活性。b) 另一类抑制剂与底物具有相同结合位点，影响底物与BCRP的结合。c) 还有一类抑制剂结合在底物结合位点以外，通过结合后引起BCRP构象变化，从而影响底物的转运[5]。第三种机理报道较少，抑制剂结合位点可能是细胞内也可能是细胞外；其他两种抑制机理均需要抑制剂先进入细胞。
而PROTAC分子的一个普遍特性是肠道渗透性较差，尽管Caco2细胞外的PROTAC浓度较高，但进入到细胞内的药物浓度可能很低。因此我们推测，很可能是因为Caco2细胞内PROTAC的浓度太低，导致不能发挥抑制作用。
图4. 细胞内抑制剂浓度低不能发挥抑制作用
02 定制化研究
综合以上问题分析，我们尝试了药明康德DMPK的高表达BCRP膜囊泡模型。膜囊泡可使ABC转运体的底物结合位点暴露于细胞外缓冲液中，可用于研究候选药物作为底物和抑制剂与ABC转运体的相互作用。下图解释了外翻膜囊泡的机理，原本外排转运体介导的底物转运方向为从细胞内转运至细胞外，经翻转后底物的转运方向变成从细胞外转运至细胞内。在该模型中，抑制剂可以在膜外与转运体底物结合位点直接接触。
图5. 外翻膜囊泡机理
03 结果和讨论
进一步采用BCRP膜囊泡模型测得该PROTAC分子对BCRP具有很强抑制作用，与文献报道相符。相对于常规方法无法得到抑制窗口，囊泡法评估外排转运体抑制更加灵敏。这个案例值得我们重新审视PROTAC分子对外排转运体的抑制研究。除BCRP转运体外，PROTAC分子对其他外排转运体抑制研究，也可能存在同样的问题。采用完整细胞模型评估PROTAC分子对外排转运体的抑制，可能因为PROTAC的渗透性差难以进入细胞，从而低估PROTAC对外排转运体抑制的风险。膜囊泡模型可能更适合研究低渗透性的PROTAC分子对外排转运体的抑制作用。
结语
药明康德DMPK部门一直致力于帮助客户设计合理的实验方案，解决各种药代动力学相关的问题。我们积累了丰富的PROTAC研发经验，形成PROTAC的药代动力学研发策略，可助力客户快速推进PROTAC新药研发项目。此外，药明康德DMPK也具有非常全面的转运体研究平台，除了FDA推荐的9种药物转运体外（P-gp, BCRP, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, MATEs (MATE1, MATE2-K), OAT1和OAT3），还可以评估化合物与其他药物转运体的相互作用，包括OATP2B1、OCT1、PEPT1、PEPT2、NTCP、ASBT、BSEP、MRP1/2/3/4等。在膜囊泡模型方面，药明康德DMPK具有高表达P-gp、BCRP、BSEP、MRP1/2/3/4等外排转运体的膜囊泡体系，可满足各种类型转运体相互作用评价的需求。
药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。
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作者：马利萍，李成园，金晶
编辑：熊涛，方健，钱卉娟
设计：倪德伟
参考
[1] DOI: 10.1200/JCO.2020.38.15_suppl.3500 Journal of Clinical Oncology 38, no. 15_suppl (May 20, 2020) 3500-3500.
[2] Lee CA, O'Connor MA, Ritchie TK, Galetin A, Cook JA, Ragueneau-Majlessi I, Ellens H, Feng B, Taub ME, Paine MF, Polli JW, Ware JA, Zamek-Gliszczynski MJ. Breast cancer resistance protein (ABCG2) in clinical pharmacokinetics and drug interactions: practical recommendations for clinical victim and perpetrator drug-drug interaction study design. Drug Metab Dispos. 2015 Apr;43(4):490-509.
[3] International Transporter Consortium, Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KL, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM, Hoffmaster KA, Ishikawa T, Keppler D, Kim RB, Lee CA, Niemi M, Polli JW, Sugiyama Y, Swaan PW, Ware JA, Wright SH, Yee SW, Zamek-Gliszczynski MJ, Zhang L. Membrane transporters in drug development. Nat Rev Drug Discov. 2010 Mar;9(3):215-36.
[4] In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. FDA. 2020 Jan.
[5] Mao Q, Unadkat JD. Role of the breast cancer resistance protein (ABCG2) in drug transport. AAPS J. 2005 May 11;7(1):E118-33.
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