定量全身放射性自显影技术（QWBA）使组织分布实现可视化

定量全身放射性自显影技术（QWBA）是一种成熟的放射性示踪技术。

动物给予[¹⁴C]/[³H]标记的受试物后，应用定量全身放射性自显影技术（QWBA）研究总放射性在全身的分布情况，可以得到完整详细的组织分布结果，并可以根据各组织中的暴露量和消除半衰期评估人体可接受的放射性安全剂量。这一技术不管是在药物发现还是开发阶段，均有广泛的应用。

一、与传统组织分布相比定量全身放射性自显影技术(QWBA)的优势

QWBA可定量检测的组织个数远高于传统摘取组织的实验方法，主要设备见图1。

图1 QWBA实验的主要设备 左冷冻切片机，右成像仪

常规的组织分布，将[¹⁴C]/[³H]受试物给予动物后在不同的时间点摘取计划好的组织，按照国内目前的指导原则要求，通常约13个左右。然后将组织匀浆、取样，用质谱测定原型的浓度或者用液体闪烁计数仪测定总放射性的浓度，而QWBA实验收集不同时间点的动物尸体，将动物尸体进行冷冻切片，显影，曝光，可以看到全身多个组织（45种甚至更多）的分布情况。

实验结束后，当研究者需要增加了解计划外的组织分布情况时，传统组织分布的研究方法只能通过重新给药收集样品。QWBA可保存全身的影像，通过在原影像上增加勾画组织，随时可以实现组织种类的补充。

QWBA可覆盖超过全身体重95%的组织种类，包括很多精细的小组织，比如角膜、虹膜、泪腺、胆管等，这些很难摘取的组织中如果含有较高的分布浓度，会造成潜在的安全隐患。因此采用QWBA观察受试物在临床前动物种属全身的分布，可以在临床试验开展前，更全面的预测临床风险，科学地估算临床放射性给药剂量。 与传统组织分布研究方法对比，QWBA具有诸多优势（图2）。

图2 QWBA与传统组织分布研究方法对比

二、何时开展QWBA比较合适

小分子的受试物在动物或者人体内的药代动力学研究，即ADME研究，包括了吸收、分布、代谢和排泄的研究。在筛选阶段，可以选择[³H]标记候选受试物*，通过QWBA快速地判断受试物生物利用度低的具体原因（不吸收或代谢快等）。

QWBA还可以用于判断受试物在靶器官是否有足够的分布浓度，帮助选择合适的受试物推进到IND阶段。在IND阶段，根据受试物的化学结构、合成工艺、早期代谢产物鉴定结果设计合理的[¹⁴C]标记位点**，利用[¹⁴C]标记的受试物进行相应动物模型的QWBA研究，同时伴随着物质平衡、胆汁排泄和代谢产物鉴定的研究。

到了临床阶段，特别是POC验证后，需要人体放射性物质平衡的研究来回答受试物在人体内的排泄和转化途径。此时需要含色素大鼠的QWBA实验来推算人体可以接受的放射性剂量，作为临床顺利通过伦理审批的依据。

*筛选初期[³H]可以采用非定位标记，不需要制定复杂的合成路径，通过氢氚交换降低成本，缩短周期，因此比[¹⁴C]标记更为便捷；**IND阶段采用[¹⁴C]标记，合成步骤相对[³H]较复杂，但具备定位标记，体内稳定性好的优点，因此适用于在申报阶段的体内实验中开展。

图3

三、如何进行QWBA的实验设计

分为两种场景，一种是和IND实验一致，采用药效和毒理研究中使用的动物模型，通常为白化啮齿类动物，雌雄各半，给药后收集4~5个时间点。另一种是采用支持临床放射性剂量推算的含黑色素的啮齿类动物，比如Long Evans和C57品系的啮齿类动物，一般仅雄性，给药后收集8~10个时间点的动物尸体进行切片。给药剂量在药效剂量范围内，通常与IND中剂量保持一致，放射性剂量一般为100~200µCi/kg。

目前，中国研究白化大鼠的组织分布一般通过LC-MS测定原型，或通过放射性液闪仪测定总放射性来实现。在FDA申报的项目中，绝大部分研究都是通过放射性QWBA实验来实现。而人体放射性剂量推算均是通过含黑色素啮齿类动物的QWBA实验来完成。

人体是含有黑色素的，而酪氨酸酶的抑制剂比较容易和黑色素结合并蓄积，在临床症状上会表现为各种不良反应，比如：皮疹和皮肤瘙痒。临床试验前，需要应用含黑色素的啮齿类动物来评估受试物是否存在色素结合。

四、QWBA的可视化应用

分别给予白化大鼠和含黑色素大鼠[¹⁴C]标记的受试物，根据后者含色素组织（含色素皮肤和葡萄球膜）和前者之间的分布差异，评估受试物是否存在黑色素结合。

口服10mg/kg的[¹⁴C]受试物后第一周和第四周的放射性的组织分布图谱，在两种大鼠中均可以看到该受试物与皮肤有明显的结合并且蓄积的趋势。但两种大鼠又有所不同，含黑色素大鼠的葡萄球膜上的分布和蓄积也非常的明显，说明该受试物与黑色素有特异性结合的趋势（图4）。

图4 口服10mg/kg的[¹⁴C]受试物后第一周和第四周代表性全身定量放射自显影图



QWBA影像通过不同的色彩对应不同的浓度水平，清晰的呈现组织外层和内层之间的浓度差异，对于评估抗癌药物是否能到达肿瘤组织，以及达到的深度和广度具有传统组织分布不可比拟的优势。

采用[¹⁴C]标记靶向叶酸受体的叶酸埃博霉素连接物，小鼠口服给予[¹⁴C]标记的连接物后，放射性广泛分布在各组织器官，极少量物质能进入脑部，QWBA影像显示含叶酸受体的肿瘤组织周围有明显的放射性分布，无叶酸受体分布较少。在给药后48h，虽然放射性从各组织中迅速消除，但含受体的肿瘤组织中仍有比较高的分布，可全面支持药效数据（图5）。

图5 荷瘤鼠给予[³H]BMS-753493后，不同FR表达的M109肿瘤中放射性分布图^[1]

创新药在三期和四期临床实验中需要完善对怀孕和妊娠妇女及胎儿的影响，考察是否会通过胎盘屏障和血乳屏障到达胎儿或者幼儿，在药品使用说明书中补充孕妇和妊娠妇女的用药指南。

妊娠小鼠在注射[¹⁴C]双酚A后，其放射性自显影图片上可清楚的呈现[¹⁴C]双酚A除了会分布于母体腹腔的各主要器官，也通过胎盘屏障到达了胎儿（图6），因此在妊娠的时候提倡使用不含双酚A的产品。

图6 注射[¹⁴C]双酚A后，孕鼠和胎鼠体内的放射性分布图^[2]

五、QWBA是组织分布研究的金标准

QWBA是分析受试物组织分布的非常有力的一个工具，它具有分辨率高、物质种类全、组织范围全、时间跨度全、以及可定量的绝对优势，可应用于药物开发和申报的任何一个阶段，及时准确地发现受试物相关的靶向器官。QWBA提供的数据常用于解释药效学、毒理和药理学相关的研究结果，系统地诠释药物在体内的转化过程。

QWBA目前在中国还处于起步的阶段，药明康德DMPK已在2020年建立QWBA平台，并成功开展了多个研究项目，包括常规啮齿类动物、荷瘤鼠、小型猪（皮肤）。通过这一平台，我们将助力客户更快更好地进行药物的开发。

图7

• 药明康德药性评价部放射性实验平台提供多种动物（CD-1小鼠、C57小鼠、SD大鼠、LE大鼠）模型用于QWBA研究。

• 于给药后特定的时间点各取一只动物采集全血后安乐死，并将尸体置于液氮内冷冻。应用定量全身自显影技术（QWBA）测定组织中（包括内容物）及目标区域（AOI）总放射性。

• 应用Leica CM3600 XP冷冻切片机进行矢状位切片，经曝光显影后，应用AIDA软件的区域取样功能，定量分析所选组织及感兴趣区域的放射性浓度。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：于雪，张玲玲

编辑：方健

设计：倪德伟