多肽药物的发展及其分析策略
多肽药物具有靶点明确、成药性好等优点，现今已成为新药研究的热点之一。多肽是由氨基酸缩合连接而成，具有一定生物活性的化合物分子。相对于蛋白质，空间结构较为简单、稳定性较高，且免疫原性较低。多肽广泛应用于疫苗、抗肿瘤、内分泌、心血管等医疗领域，具有副作用小、特异性强、效果显著、生物活性高、用药剂量少、不易产生耐药性等诸多优点，但也存在半衰期短、不稳定、易降解、口服吸收率低等不足。本文梳理了多肽药物的发展以及在生物样品分析中面临的诸多挑战，并有针对性的提出了多肽分析的策略。
一、多肽药物，从不被看好到赛道火热
胰岛素是第一款在临床上应用的多肽药物，为Ⅰ型糖尿病治疗带来了革命性的变化。很快，多肽作为生物反应调节剂的重要性，以及其高效、高选择性、低毒性的特点被关注。但与小分子药物相比，多肽口服生物利用度低、血浆稳定性差、循环时间短等局限性也被暴露。此外，对于制药企业而言，多肽生产成本居高不下，致使多肽药物的发展在1970s-1980s进入停滞期。
直到1980s后期，研究发现多肽可以作为受体的亚型选择探针，以及其长期作为先导化合物存在，奠定了多肽药物发展迎来第二次浪潮的基础，同时吸引了风险投资和生物技术公司的关注。此后，药物递送技术、制剂、合成技术也取得长足的发展，更加奠定了多肽药物市场的可观前景。
从2000年到2010年进入临床研究的多肽翻了一番。截止到2020年，已经有80多个多肽药物上市，150多个多肽处于临床研究阶段，400-600个多肽化合物处于临床前研究阶段。
图1：多肽药物的发展及里程碑（图源：参考文献[1]）
1959-2019年获批的多肽药物呈明显的增长态势，年均增速约为7.7%。这些药物多属于激动剂，用于多种疾病治疗，包括糖尿病、癌症、骨质疏松症、多发性硬化症、HIV感染和慢性疼痛等。2019年1.2万亿美元的药物市场，多肽药物占据5%的市场份额，胰岛素及其类似物250亿美元的销售额约占多肽药物市场的50%。
图2：多肽药物市场（图源：参考文献[1]）
表1：2019年多肽药物销售额排名（表源：参考文献[1]）
二、LC-MS在多肽生物分析中的优势
多肽常用的生物样品分析方法主要有配体结合分析法（LBA）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS）。LBA和LC-MS比较，LC-MS具有时间短、成本低、选择性高、特异性强、高通量等优点，在临床前先导化合物筛选阶段，具有很强的优势。
表2：LBA 和LC-MS 比较[2]
下表是对近年来典型的多肽药物生物样品分析方法进行了整理归纳，LC-MS技术因具有更高的选择性、分离度、灵敏度及通量大的特点成为多肽药物分析的主要技术手段之一。
表3：多肽药物生物样本分析方法举例
三、LC-MS分析多肽的挑战及策略
利用LC-MS技术分析多肽化合物时，面临响应低、非特异性吸附、内源性干扰、稳定性差等问题，可采用如下策略进行解决：
响应低
优化样品前处理方法，提高化合物提取回收率；优化色谱条件和质谱方法，提高化合物响应；
非特异性吸附
使用低吸附耗材；添加合适的表面活性剂、筛选有机溶剂、富含蛋白质的溶液等进行解吸附；
内源性干扰
优化色谱条件和质谱方法，将化合物和内源性干扰分离；或选用无干扰的替代基质；
稳定性
低温湿冰操作或者筛选添加合适的稳定剂。
下图是药明康德DMPK实验室根据多年利用LC-MS分析多肽化合物的经验，总结出如下流程图。主要总结了从样品前处理、色谱条件、质谱条件三方面进行方法优化，以期达到预期定量分析检测要求。而稳定性问题与特定的结构相关，需要具体问题具体分析，这里不再做进一步的讨论。
图3：LC-MS分析常规多肽化合物的流程图
我们的平台拥有高端的Triple quadrupole、TOF和Orbitrap质谱，7年多分析了近千个多肽化合物， LLOQ可达pg/mL级别，常规多肽化合物方法开发4-8小时完成，项目分析48-72小时完成（≤500个样品）。
四、LC-MS分析多肽的案列
案例1：LC-MS 分析艾塞那肽
艾塞那肽为胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物Exendin-4的人工合成品，由39个氨基酸组成，主要用于Ⅱ型糖尿病的治疗。我们建立了艾塞那肽的生物分析方法，LLOQ 达到20.9 pg/mL，如表4所示，我们的结果可以媲美放射免疫分析（RIA）。
图4(a)：空白样品的LC-MS图谱；(b):LLOQ（20.9 pg/mL）的LC-MS图谱
表4：艾塞那肽分析方法的比较
案例2：LC-MS分析聚乙二醇修饰的多肽
聚乙二醇（PEG）修饰可以用来增强蛋白质或多肽药物的稳定性、溶解性和安全性。然而，多肽药物PEG修饰后因其结构变大、分散的分子量、非特异性结合的倾向以及在蛋白质沉淀处理时的共沉淀问题，导致在建立分析方法时面临诸多挑战。下面是一个通过离子源内裂解产生的碎片来定量检测PEG偶联多肽的案例。该方法验证了在10-10,000 ng/mL线性范围内的线性关系、灵敏度、准确度、精密度、残留和选择性等多项内容，并已应用于小鼠的药物代谢动力学研究。
图5：PEG偶联多肽在源内裂解后获得Q1的图谱
表5：PEG偶联多肽的 LC-MS条件
结语
多肽化合物存在口服生物利用度低，血浆稳定性差，循环时间短等局限性，需要借助化学修饰和药物递送系统改善成药性，因而对临床早期的研究提出了新挑战。多肽的药代动力学特征与其理化性质、化学修饰、载药系统、偶联药物性质密切相关，而良好的生物分析方法对于多肽的药代动力学和毒代动力学的研究至关重要。LC-MS技术可为多肽分析提供准确、快速的结果，高效的先导化合物筛选，但其分析也有着诸多难点。药明康德DMPK拥有丰富的分析经验，并与大家分享了相关分析策略。后续我们将持续推出DMPK相关干货文章，欢迎关注讨论~
药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。
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作者：刘艳凤，胡维民，曹卫群
编辑：方健，钱卉娟
设计：倪德伟
