液相色谱-质谱联用在寡核苷酸药代动力学定量分析的应用

在药物研发阶段，生物样品中寡核苷酸的定量分析及其代谢产物的鉴定在药代动力学(PK)，药效学(PD)和毒理安全评价中是至关重要的。不仅为寡核苷酸提供PK、毒代及代谢途径的重要信息，还对这类药物的结构改造及递送系统的优化起到指导作用，达到改善药物的稳定性和提高递送效率的目的。相较于传统小分子药物，寡核苷酸在给药后在体内分布迅速，然后进入消除相，消除相的血药浓度低并维持长，而在组织如肝、肾中积累，具有较高的暴露量。因此寡核苷酸生物样品中的定量分析方法对灵敏度的要求差异很大，在血浆/血清中需要有较高的灵敏度，而在体组织中需要有与高暴露量相符的灵敏度和检测范围。

图1：寡核苷酸在大鼠血浆及肝组织匀浆中的PK曲线及其组织分布（图源：参考文献^[1]）

一、LC-MS技术的优势

目前寡核苷酸的定量分析方法包括基于杂交技术的酶联免疫法（HELISA）和高效液相荧光检测法 (HPLC-FL)、高效液相色谱法 (HPLC-UV)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)。

HELISA和HPLC-FL的方法开发需要设计及合成专属的试剂，因此方法开发的周期较长、成本高，成为寡核苷酸药物研发，特别是早期药物筛选的瓶颈。HELISA以其高灵敏度和高通量的显著优势在寡核苷酸的PK研究中获得了广泛应用。但它无法区分全长的寡核苷酸和核酸酶解的代谢产物，易产生交叉杂交的现象，导致原药浓度被高估。

HPLC-UV 由于检测灵敏度较低，无法用于低浓度样品的生物分析。

LC-MS技术将具有高分离能力的液相色谱法与高灵敏度和选择性的质谱法结合起来,除了可以对寡核苷酸在生物样品中进行准确的定量分析，还可以提供碱基组成、序列结构等信息，用于对代谢产物的鉴定。质谱平台不需要特殊试剂的设计和合成，方法开发周期短，可以大大加快药物研发的速度。因此，在早期体内体外的药物筛选和非临床实验中，LC-MS可以代替ELISA方法对寡核苷酸的生物样品进行定量分析，提供更加有效、灵敏、快速和精确的实验数据。

二、LC-MS应用于寡核苷酸定量分析的流程

利用LC-MS对寡核苷酸生物样品的定量分析，也可以归纳为以下：样品采集（组织样品需匀浆），样品前处理及在质谱上的分析，如下图所示。 

图2：使用LC-MS定量分析寡核苷酸的流程（图源：参考文献^[2]）

三、LC-MS技术的挑战

寡核苷酸亲水性强，离子化效率低、容易产生大量的金属加和离子以及由这些性质导致的生物样品回收率不稳定和分析中存在严重的基质效应、灵敏度低等问题，都成为LC-MS生物分析方法中要攻克的难关。提高生物样品中的寡核苷酸在质谱上的灵敏度，可以采用以下三种方法：

1. 优化样品前处理，提高寡核苷酸在生物样品中的回收率；

2. 通过改善寡核苷酸的多电荷分布，针对丰度较高的前离子体优化质谱参数；

3. 减少待测物在质谱分析时加合离子的形成。

四、样品前处理方法开发

在分析寡核苷酸时，样品前处理方法开发与LC-MS分析条件的建立同等重要。样品前处理的注意点有以下几项：

1. 一般情况下，我们比较常见的寡核苷酸萃取方法有使用液-液萃取（LLE）和固相萃取(SPE)两种。对于LLE方法，样品和有机溶剂的充分混合及完全分离是除去生物样品中蛋白的重要步骤。而对于SPE 方法，需要严格控制pH值以保证较高的提取回收率。

2. 寡核苷酸在聚丙烯和玻璃容器中均存在非特异性吸附，采用低吸附耗材及对容器进行烷基化处理并采用TEA的溶剂溶解样品，能够避免非特异性吸附。

3. 氮气吹干仪通常用于浓缩HPLC分析进样前的寡核苷酸样品，但蒸发至完全干燥的样品有时会影响回收率。

4. 在建立方法中，也要充分考虑到寡核苷酸的化学修饰和递送系统对其化学特性和极性的改变，对现有的萃取方法进行优化。

五、LC-MS方法开发

LC-MS 方法开发主要是涉及色谱柱的选取，缓冲液及质谱参数的优化。目前已经有多款针对寡核苷酸的液相分离的色谱柱，例如Phenomenex Clarity Oligo-RP 及Thermo DNAPac™ PA200 RS等，在此不再赘述。

离子对缓冲液HFIP/TEA体系可以用于保留高极性且带阴离子的寡核苷酸，并被广泛用于寡核苷酸LC-MS的分析, 但同时TEA可以通过离子键和寡核苷酸形成“假中性分子”， 造成寡核苷酸的电荷被屏蔽，抑制质谱响应。因此离子对试剂所提供的保留必须与其离子抑制相平衡从而最大限度地提高生物分析在质谱上的灵敏度。TEA属于难于挥发性碱，易吸附在质谱检测器上，造成污染并导致质谱检测灵敏度显著下降。近年来，亲水相互作用液相色谱（HILIC）也被用于寡核苷酸色谱分离，用于替代离子对缓冲液，以减少对质谱检测灵敏度的影响。

寡核苷酸在ESI源负离子模式下响应较好，且易形成多重电荷形式的离子，在选定离子对后，MRM优化步骤与小分子类似。高分辨质谱，特别是全扫描的应用，不需要对每个寡核苷酸针对性的质谱参数优化，大大简化了质谱参数的优化过程，缩短方法开发时间。

六、高分辨质谱的应用

在寡核苷酸的分析中，常见的质谱是三重四极杆质谱(Triple quadrupole MS)、离子阱质谱(Ion Trap MS)和飞行时间质谱(TOF MS)。

• Triple quadrupole MS具有离子传输效率高，动态范围宽和灵敏度高的特点，在定量分析中具有显著的优势, 被广泛地用于寡核苷酸的生物样品定量分析，其灵敏度可达到5-10 ng/mL。寡核苷酸在Triple quadrupole MS中经过碰撞诱导接力主要产生m/z 125胸腺嘧啶和m/z 95磷酸的碎片离子，对序列分析没有帮助。

•  Ion Trap MS能够产生与寡核苷酸序列相关的诊断性离子，这些离子不仅可以用来对寡核苷酸进行定量，还可以用于鉴定其代谢产物。

• TOF MS多用寡核苷酸样品合成的杂质分析。

近些年来，高分辨率质谱（HRMS）全扫描在寡核苷酸定量分析的应用中引起了人们极大的兴趣。这种方法不仅可以提供目标寡核苷酸的定量信息，而且还提供杂质和代谢产物相关的信息。静电场轨道阱超高分辨质谱(Orbitrap HRMS)的检测灵敏度与三重四极杆质谱近似， 宽线性范围，质量偏差小于3ppm，具有HDC碎裂模式，丰富的离子碎片用于代谢产物鉴定。如图3所示，利用静电场轨道阱超高分辨质谱(Orbitrap HRMS)在大鼠血浆对siRNA进行定量分析，其在血浆中检测灵敏度可达10 ng/mL。

图3：利用Orbitrap HRMS全扫描对大鼠血浆中siRNA进行定量分析 (线性范围: 10-2500 ng/mL)

此外，四极杆飞行时间质谱(Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry，QTOF MS) 将四极杆-飞行管两种质量检测器联用，也可用于寡核苷酸的体外代谢研究和序列确认。寡核苷酸的代谢产物鉴定，修饰位点的确证，需要专业软件提供成分分析方法，识别新峰。比较常用的寡核苷酸序列确证软件有BioPharma Finder 4.0 software (Thermo Scientific)及Promass (Novatia，LLC)。

随着质谱技术的不断发展，毛细管电泳/质谱联用系统(CE/MS)，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，离子迁移率质谱仪(IM-MS)也被用于寡核苷酸生物样品的定量分析。

药明康德DMPK已完成包括脑、肝、肾等20多种生物组织及生物流体中ASO和siRNA的质谱定量方法开发，已被用于多个种属体内体外试验的生物样品分析，并满足IND申报要求。目前，在已经开发的质谱定量方法中，寡核苷酸在生物基质中的定量下限为1~10 ng/mL。

图4：药明康德DMPK质谱平台

七、寡核苷酸的LC-MS生物分析方法建立流程

结合我们的经验，将寡核苷酸的生物分析方法建立的流程总结为以下5步：

质谱条件优化

确认待测物电荷分布状态；

优化缓冲液体系，减少加合离子；

优化MRM条件，可使用多个MRM提高灵敏度。

色谱条件优化

尝试不同的缓冲液体系和色谱柱；

进一步优化色谱条件，改变梯度和柱温， 分离待测化合物和干扰。

样品储存条件优化

使用适当的容器和溶剂，避免低浓度样品的非特异性吸附；

确认样品储存稳定性（温度）。

样品提取条件优化

优化样品萃取方法的回收率；

考察吹干及复溶过程的稳定性。

方法确认

进一步优化方法以满足灵敏度的要求；

考察方法的选择性/重现性/基质效应；

确认样品处理过程中的稳定性。

结语  

作为新一类药物分子，寡核苷酸极性大、带电荷、需要借助化学修饰和递药系统改善成药性，因而具有不同于化学小分子和单抗药物的临床药理学特性，为临床早期研发带来新挑战。

寡核苷酸的药代动力学特征和核苷酸的理化性质、化学修饰、载药系统、偶联物性质密切相关，而良好的生物分析方法对于寡核苷酸药代动力学和毒代动力学的研究至关重要。LC-MS为寡聚核苷酸的生物分析提供准确、快速、可靠的结果。高分辨质谱提供高达 500,000 的分辨率、高灵敏度、快速的扫描速度和更大的动态范围，并且可以在同一台质谱上可以寡核苷酸的定量分析，序列鉴定及代谢产物分析。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：赵楠

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟