ADC的A（antibody）和D（drug）通过linker偶联，根据ADC药物释放小分子毒素的形式不同， ADC药物分为可裂解linker型和不可裂解linker型。
可裂解型ADC会断裂连接子linker与payload之间的化学键，释放出小分子毒素，而不可裂解型的ADC释放小分子毒素是通过抗体部分氨基酸序列的水解得到的。
作为发挥药理活性的主要成分，应当尽早地确定ADC化合物释放出的小分子毒素结构，这些化合物同时也是后续ADME研究的对象，在PK或TK实验中需要同步检测其含量。
一、研究模型
研究ADC药物的体外代谢模型有多种系统，根据ADC药物的作用机理可以选择肝溶酶体和肝S9研究小分子毒素的释放，通过肿瘤细胞的孵育可以研究ADC在药效模型中释放的小分子毒素，明确药效模型中的起效物质。当确定主要的ADC裂解产物后，可以用肝细胞、肝微粒体或者是肝S9开展小分子代谢途径的研究，包括种属差异的比较，为毒理种属的选择提供依据。
图1. ADC药物代谢研究策略
ADC在体内的代谢研究主要集中在血浆中小分子毒素的鉴定，可以验证ADC药物在体循环中的稳定性，以及ADC药物在靶器官释放出的小分子毒素在体循环中的代谢产物分布情况。放射性同位素标记的ADC可以用于研究荷瘤小鼠的组织分布，以评估ADC在靶组织中的富集程度。
二、分析方法
任何药物代谢实验都有两个不能缺失的关键部分，生物代谢系统和分析方法。由于ADC药物释放出的小分子毒素浓度很低，且不可裂解型ADC的裂解产物很难预测，在检测中存在诸多挑战。为此我们建立了用于发现和鉴定ADC药物释放的小分子毒素的液相-高分辨质谱（LC-HRMS）方法，在数据处理中同时运用靶向和非靶向的分析技术，以快速和全面地发现未知连接位点或连有未知氨基酸序列的小分子毒素。
图2. ADC代谢产物的高分辨质谱分析方法
图3. 背景扣除后的高分辨质谱图
高分辨质谱可以准确分辨出代谢产物信号与几个mDa质量偏差的背景杂质信号，运用背景扣除技术可以将产物的质谱信号从复杂背景信号中凸显出来，是一种典型的非靶向数据分析技术。
三、案例解析
案例一
非靶向性的高分辨质谱仪方法寻找ADC-1在体外溶酶体中释放的小分子毒素
图4. ADC-1的结构示意图
ADC-1属于不可裂解型ADC，其中小分子毒素通过连接体在抗体的赖氨酸上与抗体部分偶联。ADC-1和相应的抗体分别放在酸性的人溶酶体孵育体系中孵育48小时，由高分辨质谱仪采集一级和二级数据。如下图所示，ADC-1在酸性溶酶体中孵育后，得到LC-UV、LC-HRMS及经背景扣除处理后的样品色谱图。
图5. ADC-1在酸性溶酶体孵育后的（A)LC-UV；(B)LC-MS/MS和（C）背景扣除的LC-MS/MS
如图所示的ADC-1所释放的主要降解产物为Lys-linker-payload，与文献报道的结果一致，证实了体外代谢体系及检测方法的可靠性。除主要降解产物外，通过背景扣除的方法处理后还可以观察到连有未知氨基酸序列的次要代谢产物，说明非靶向的数据处理技术可以帮助发现未知降解产物。
案例二
高分辨质谱仪技术分析ADC-2在酸性肝脏S9中释放小分子毒素
图6. ADC-2的结构示意图
我们将建立的检测方法应用于分析未知药物ADC-2，它由已知的小分子毒素和新的抗体组成。将其与肝S9孵育48小时后，用LC/HRMS获得了全扫描色谱图（见下， A图），但是由于从ADC-2所释放的小分子毒素浓度较低，受基质干扰较为严重，A图没有显示出小分子毒素。背景扣除数据处理有效地去除了基质干扰信号，所获得全扫描LC/HRMS色谱图（B图）显示Cys-linker-payload为主要降解产物。
根据Cys-linker-payload的母离子我们在用数据依赖性方法采集的MS/MS数据中获得Cys-linker-payload的MS/MS图谱，以此解析了Cys-linker-payload的结构， 并且确认了ADC-2中连接小分子毒素的位点和小分子毒素的释放机理。
图7. ADC-2在肝S9孵育后的(A)LC-HRMS和（B）背景扣除的LC-MS/MS
小结
用非靶向性的高分辨质谱方法寻找ADC在体外酸性条件与肝脏溶酶体和S9孵育中所小分子毒素的两个例子说明：
肝脏溶酶体和S9是研究ADC释放小分子毒素的有效的体外代谢模型；
非靶向性的高分辨质谱分析技术是发现和鉴定ADC所释放的未知小分子毒素的有效方法。
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作者：蔡婷婷，施立琦，朱明社
编辑：方健
设计：倪德伟
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