寡核苷酸（Oligo）药物的代谢特征及体外代谢研究体系选择

药物代谢是药物在体内清除的主要途径之一。对于近年来比较热门的寡核苷酸（Oligonucleotides，Oligo）药物，其代谢机理不同于常规小分子。Oligo药物的代谢酶主要为核酸外切酶（Exonuclease）和核酸内切酶（Endonucleases），广泛分布于血液和各个组织器官，在各个种属中的分布具有保守性，因此Oligo药物在各个种属之间的代谢一般不具有较大差异。常规用于小分子研究的代谢体系，并不适用于Oligo的代谢研究。因此在研发的早期，选择合适的代谢体系进行Oligo的筛选和评价尤为重要。事实上，用于评价寡核苷酸药物体外代谢的体系尚未得到广泛验证。寡核苷酸类药物目前研究的热点主要集中在小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotide，ASO）药物，本文主要介绍上述两种药物的代谢特点以及针对Oligo药物的体外代谢研究体系选择。

一、寡核苷酸药物的代谢特征

siRNA代谢

核酸外切酶从末端代谢AS链或SS链，而核酸内切酶从中间的某一位置切断，形成不同长度的链，如图1所示。2022年上市的siRNA药物Vutrisiran的代谢通路，其AS和SS链均未发现核酸内切酶代谢产物；核酸外切酶的产物，以3’末端代谢的产物为主，产生少量5’末端代谢的产物。对于siRNA更关注反义链的代谢，因为反义链与互补mRNA结合，在RISC复合体作用下促进对应mRNA的降解。3’ N-1(AS)是血浆和肝脏中常见的代谢物，一般也具有活性，有限的数据证实，该活性代谢物在RISC中的装载效率与原型相当。上市药物Givosiran的代谢物3’N-1(AS)的体外活性和原型相当^[1]。也有文献报道，3’末端代谢后的AS链活性会随着水解程度而逐渐递减，甚至失去活性；而5’末端代谢后的AS链通常会失去活性，见表1^[2]。

图1. siRNA的代谢示意图^[2]

表1.siRNA代谢物的药理活性评估^[2]

上市siRNA药物，绝大多数是GalNAc偶联的Oligo。进入肝细胞后，GalNAc很快在溶酶体中被β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetylglucosaminidase）代谢，一般会检测到代谢一个、两个和全部GalNAc的代谢物，Linker也随后被肝细胞中的酰胺水解酶逐步代谢。酸性条件下GalNAc的水解速度更快，所以酸性的溶酶体环境更有利于GalNAc的水解。对于GalNAc偶联的siRNA，在血浆中SS链一般比AS链更为稳定，可能是SS链3’端的GalNAc一定程度上保护了SS链不被核酸外切酶代谢。此外，SS链GalNAc引起的空间位阻，还会影响互补AS的5 '端外切酶介导的代谢，导致AS链不容易生成5’端降解产物^[1]。

表2. 上市siRNA药物的代谢特征

*脱氨代谢导致末端的腺苷转化为肌苷

据报道除核酸酶水解，siRNA可发生脱氨代谢，比如Lumasiran的代谢。在猴肝脏样品中检测到Lumasiran的脱氨代谢物，导致AS链3’端腺苷转化为肌苷，但在猴血浆以及大鼠血浆和肝脏中未检测到脱氨代谢物，在多种属体外肝S9中也未观察到脱氨代谢物。采用人肝细胞模型(HepatoPac®)可以检测到Lumasiran的脱氨代谢物。有文献报道，ASO药物REVERSIR-A给药的猴肝脏组织中，也发现了3’端脱氨代谢产物^[3]，具体结构见图2。此类代谢产物和AS链原型的分子量只相差0.984 Da，液相很难分离，原型和代谢物往往一起出峰。液相上分离之后，即可从质量偏移和二级质谱碎片推断为末端的腺苷氧化脱胺转化为肌酐。尽管Oligo出现脱氨代谢比较特殊，但是根据目前的经验，这类代谢发生比例较低。

图2. Oligo的脱氨代谢及色谱峰

ASO代谢

和双链的siRNA相似，ASO也被核酸酶代谢为不同长度的链。不同化学修饰的ASO，代谢情况大不相同。目前上市的ASO药物，有些为PS（硫代）修饰的骨架，并在末端进一步修饰（图3a），比如在核糖的2'位置进行甲氧基乙基(MOE)、甲氧基（OME）或氟（F）取代等，代表药物有Mipomersen、Inotersen、Volanesorsen、Eplontersen、Tofersen。对于末端修饰的ASO，核酸内切酶先将寡核苷酸裂解成片段，然后在3’和5’末端进行核酸外切酶水解，代谢物片段一般较短不具有活性。另一类ASO为全长经过修饰，代表药物有Eteplirsen、Nusinersen、Golodirsen、Viltolarsen、Casimersen。全长修饰的ASO相对更为稳定，主要由核酸外切酶代谢，逐渐形成链缩短的代谢物。对于PMO（磷酸二酰胺吗啉代寡聚物）修饰的ASO（图3b），表现出非常高的稳定性，甚至不代谢^[4][5]。

图3. ASO的结构及修饰示意图

总体而言，Oligo的代谢具有以下几个特征：

• 代谢途径已知，主要经核酸外切酶和核酸内切酶水解代谢，尽管有脱氨代谢的报道，但是发生率较低；
• Oligo代谢的种属差异较小，因此可以预见人体中发现代谢产物在实验动物种属中不存在，或在动物中水平远低于人体水平的可能性较低；
• 代谢产物为水解成短链的代谢物，仅少数核苷酸被水解的代谢物可能与原型活性相当，而这类代谢物很常见，因此Oligo出现活性代谢产物的可能性较大。如果药代研究仅检测原型，可能低估药效。

二、寡核苷酸的代谢研究体系及选择

肝脏是小分子化合物的主要代谢器官，因此肝细胞、肝微粒体和肝S9体系等常用于小分子的代谢研究。参与小分子化合物代谢的酶主要是I相和II相代谢酶。但是Oligo经核酸酶代谢，核酸酶广泛存在于各个组织器官，适用于常规小分子化合物的代谢体系选择不一定适用于Oligo药物。用于研究Oligo代谢的体系较多，如表3所示为常用于Oligo体外代谢的研究体系。一个合适的体外代谢体系，能够最大程度预测体内的情况。早期筛选阶段，化合物数量很多，体内动物实验周期较长，成本很高，很难通过体内实验大批量进行化合物筛选或结构优化。因此，合适的体外代谢研究对于Oligo化合物的早期筛选尤为重要。体外代谢研究具有通量大，实验周期短等优势，更有助于我们提高Oligo药物筛选速率。

表3. 寡核苷酸的体外代谢研究体系及特点

核酸酶  

核酸酶可分为核酸内切酶和外切酶，外切酶负责从末端切割相邻核苷酸之间的磷酸二酯键。内切酶在功能上是相似的，但切割发生在核酸链的内部位置。Pegaptanib采用含有核酸内切酶、3’和5’核酸外切酶、核糖核酸酶的混合酶溶液进行体外代谢研究，结果显示核酸酶孵育5h后，原型的剩余百分比为6.1-17.6%。其余上市Oligo药物，只有Viltolarsen的申报资料中提到核酸酶代谢稳定性但未有数据展示。根据相关文献报道，核酸酶的代谢能力有限。比如Kim等人研究发现，ASO化合物经纯化的核酸内切酶（RNase A）和外切酶（Exo-T）孵育2天未产生降解，但是在肝匀浆和体内均产生降解^[6]。Robin等人采用3’核酸外切酶（Nuclease P1）研究寡核苷酸的体外代谢，发现单链的寡核苷酸很快被代谢但是双链的寡核苷酸是稳定的^[2]。

血清/血浆  

上市的6款siRNA药物，有5款均采用血清进行代谢稳定性研究，并展示不同的稳定性结果。而上市的ASO药物，只有Pegaptanib的申报资料中展示了血浆稳定性数据。血浆孵育5h，Pegaptanib在人、兔、犬和猴血浆中剩余率为12.9%->100%。其余ASO药物申报资料未展示血浆或血清稳定性数据。已经上市的适配体药物Avacincaptad Pegol也研究了血清稳定性，孵育24、48和72小时后，一个潜在代谢物在猴血清中占原型的9、12和14%；在大鼠和人血清中均占原型的0、6和6%。之所以大多选择血清，可能考虑制备血浆需要加入抗凝剂，而常用抗凝剂之一EDTA为核酸酶的抑制剂，因此EDTA抗凝的血浆不适用于Oligo的体外稳定性研究。肝素钠抗凝的血浆理论上也适用于Oligo的稳定性考察。

表4. 上市siRNA药物在血清中稳定性

M:小鼠；R:大鼠；C:猴；H:人

肝S9  

已经上市的6款siRNA药物，有5款进行了多种属肝S9的代谢稳定性研究，且存在不同程度的代谢。从代谢趋势看，没有明显的规律。根据我们的研究经验，体内肝脏中SS链很快水解脱去GalNAc基团，以脱去GalNAc的核酸链为主要代谢物。但是在体外S9体系中，SS链相对更为稳定，存在一定的体内外差异。所有上市的ASO药物，未在它们的申报资料中呈现以肝S9为孵育体系的代谢研究。适配体药物Avacincaptad Pegol也研究了肝S9稳定性，孵育24小时后在人、猴、大鼠肝S9中的剩余率分别为48%、0%和0%。

表5. 上市ON药物在肝S9中稳定性

M:小鼠；C:猴；H:人；R:大鼠

肝匀浆  

肝匀浆是比较推荐的体外代谢研究体系。Rosanne等人用小鼠肝匀浆进行ASO的体外代谢研究，发现和体内代谢具有很好的相关性^[7]。Babak等人用大鼠肝匀浆研究GalNAc偶联siRNA的体外代谢，同时对比了磷酸二酯酶、核酸内切酶/外切酶、血浆和血清、肝细胞、肝溶酶体等体系，发现肝匀浆的代谢体系是最佳的，肝匀浆体系代谢结果和体内代谢存在很强的相关性^[8]。Babak等人也建议在siRNA先导优化过程中采用体外肝脏匀浆稳定性试验来筛选Oligo。

肝微粒体

虽然普遍认为，常见的微粒体酶比如CYP和FMO等不参与Oligo的代谢，但是也有文献报道人肝微粒体也能代谢Oligo。Kim等人研究发现，未修饰的ASO化合物与人肝微粒体孵育12h之后被全部代谢，且代谢产物主要是3’末端降解的产物，说明存在于人肝微粒体中的主要是3’核酸外切酶。而同样的ASO化合物与核酸酶或肝匀浆孵育1h后即被全部代谢，说明肝微粒体的核酸酶活性较低^[9]。尽管肝微粒体体系可能代谢Oligo，但是与肝微粒体中CYP酶的作用无关。目前为止，未有CYP酶参与Oligo代谢的报道。

肝细胞 

Lumasiran的申报资料中提到，因在猴肝脏样品发现Lumasiran的脱氨代谢物，而在各种属肝S9体外代谢中未发现该代谢物，所以进一步采用人肝细胞HepatoPac®研究Lumasiran的体外代谢。结果显示，在孵育168h之后检测到Lumasiran的脱氨代谢物浓度高于原型，其次是3’N-1(AS)代谢物，说明人肝细胞可以产生脱氨代谢产物。Nedosiran的申报资料中，采用混悬人肝细胞进行代谢研究，但是孵育24小时没有发现任何代谢产物，可能孵育时间太短。Robin等人采用大鼠、猴和人肝细胞研究GalNAc修饰siRNA的体外代谢，发现均可产生GalNAc水解和linker水解产物，以及3’N-1(AS)代谢物。从代谢速率看，大鼠肝细胞中GalNAc和linker水解速率较猴和人种属更快。Robin等人还比较4个不同siRNA在体外肝细胞和体内肝脏代谢的结果，发现主要的代谢物在体外和体内均能被找到^[2]。OSWG推荐肝细胞作为体外研究体系^[10]，因为它最接近体内肝细胞特定区室（compartment）的摄取，而肝S9或组织匀浆可能导致药物暴露于不相关的细胞区室，因此相对于体内系统而过度暴露于核酸酶。目前用肝细胞作为体外研究体系的案例并不多，可能是由于膜屏障会使渗透性差的Oligo难以进入细胞。

溶酶体 

溶酶体是Oligo通过胞吞进入细胞后的主要接触的环境，而酸性的溶酶体（pH=~5）中含有丰富的酶体系，包括核酸酶和各种水解酶等，是Oligo代谢的重要场所，因此溶酶体是研究Oligo代谢稳定性的高效实验体系。有文献表明，GalNAc修饰的siRNA，在pH7和pH5的小鼠肝溶酶体中孵育4小时后，剩余量分别为95%和32%，提示酸性条件更有利于GalNAc的水解^[2]。Nedosiran的申报资料也显示，其在溶酶体中可代谢脱去4个GalNAc片段以及4个戊胺连接基团。

靶组织相关基质  

肝脏是Oligo的主要分布和代谢器官，也是常见靶组织，因此常采用肝脏相关基质研究Oligo的体外代谢。除肝脏外，一些局部给药的Oligo可分布至其他组织器官。考虑到核酸酶在体内广泛分布，其他靶组织也具备代谢的潜能。采用靶组织相关基质进行代谢研究，对于理解Oligo在靶组织中代谢及药效的发挥具有一定的意义。比如玻璃体注射的Oligo，可研究玻璃体液稳定性；鞘内注射的Oligo，可研究脑脊液（CSF）和脑组织匀浆的稳定性；肾靶向的Oligo，可研究肾匀浆稳定性；膀胱灌注的Oligo，可研究在尿液中稳定性等。

体外代谢研究体系的选择建议

Oligo药物一般基于平台进行开发。平台是指Oligo的结构组合，核酸长度，骨架和化学修饰，偶联物等。体外代谢研究同样基于Oligo药物的结构特点，即基于不同的平台，选择不同的体系，以及选择在不同的阶段进行体外代谢研究。对于体外代谢研究体系的选择，我们的建议如下：

• 基于已知特定平台开发的Oligo药物，与同平台的Oligo药物代谢特征相似，前期无需进行大量的代谢筛选研究，可以在拿到PK数据之后，回顾性地开展体外代谢研究或当发现PK数据异常时，进行体外代谢研究来帮助异常数据分析。代谢体系的选择，可参考相同或类似骨架已知化合物的体外代谢体系。比如上市的很多siRNA均选择了肝S9体系进行体外代谢研究，同平台的也可以选择肝S9进行。
• 基于新平台开发的Oligo药物，体外代谢研究对于平台的验证、以及了解新平台开发的Oligo药物代谢特征具有重要的意义。据我们的经验，对于新平台开发的Oligo药物，前期只用1-2个体外代谢体系去正确预测体内稳定性或代谢情况是非常困难的。因此建议在早期进行多体系代谢研究相互验证，甚至需要进行代谢体系的不断优化，来选择体内外相关性最佳的代谢体系进行筛选研究。
• 除此之外，对于肝靶向的Oligo药物，选择肝匀浆或肝S9进行体外代谢研究较为合适；对于肾靶向的Oligo药物，选择肾匀浆或肾S9进行体外代谢研究较为合适；理论上，全身组织均有代谢Oligo的潜能，局部给药局部发挥作用的Oligo，需关注在局部基质的代谢（比如CSF、脑匀浆、玻璃体液、尿液等），这些基质的代谢研究对于预测Oligo的药效具有重要的意义。

结语

已知核酸酶代谢的种属差异较小，人体产生特异性代谢物引发的代谢产物安全性风险也较低。因此，多种属体外代谢产物鉴定研究支持毒理种属选择，对于Oligo药物不认为是必须的^[10]。但是Oligo药物体外代谢研究提供的代谢产物信息，对于评估Oligo药物的量效关系具有重要的意义，因为根据已知经验，Oligo水解少数核酸的代谢产物具有与原型相当的活性，且这样的代谢产物产生的几率较大。此外，体外代谢研究对于预测临床代谢也具有重要的意义，在进入临床研究之前只能通过体外研究进行预测。对于新平台开发的Oligo药物，体外代谢研究可以在早期阶段帮助验证平台的开发是否成功，评估新平台的Oligo药物的代谢特征。药明康德DMPK有完备的体外代谢研究平台，可以根据Oligo药物的结构特征和实验目的，推荐合适的体外代谢体系用于Oligo药物的评价，助力寡核苷酸项目的早期研发。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

点击此处可与我们的专家进行联系。

作者：李倩，马利萍，金晶

编辑：钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹

参考文献：

[1] Li J, Liu J, Zhang X, Clausen V, Tran C, Arciprete M, Wang Q, Rocca C, Guan LH, Zhang G, Najarian D, Xu Y, Smith P, Wu JT, Chong S. Nonclinical Pharmacokinetics and Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion of Givosiran, the First Approved N-Acetylgalactosamine-Conjugated RNA Interference Therapeutic. Drug Metab Dispos. 2021 Jul;49(7):572-580. doi: 10.1124/dmd.121.000381. Epub 2021 May 3. PMID: 33941543.

[2] McDougall R, Ramsden D, Agarwal S, Aluri K, Arciprete M, Brown C, Castellanos-Rizaldos E, Charisse K, Chong S, Cichocki J, Fitzgerald K, Goel V, Gu Y, Guenther D, Habtemariam B, Jadhav V, Janas M, Jayaraman M, Kurz J, Li J, Liu J, Liu X, Liou S, Maclauchlin C, Maier M, Manoharan M, Nair JK, Robbie G, Schmidt K, Smith P, Theile C, Vaishnaw A, Waldron S, Xu Y, Zhang X, Zlatev I, Wu JT. The Nonclinical Disposition and Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Properties of N-Acetylgalactosamine-Conjugated Small Interfering RNA Are Highly Predictable and Build Confidence in Translation to Human. Drug Metab Dispos. 2022 Jun;50(6):781-797. doi: 10.1124/dmd.121.000428. Epub 2021 Jun 21. PMID: 34154993.

[3] Li J, J Liu, J Enders, M Arciprete, C Tran, K Aluri, L-H Guan, J O’Shea, A Bisbe, et al. (2019). Discovery of a novel deaminated metabolite of a single-stranded oligonucleotide in vivo by mass spectrometry. Bioanalysis 11(21): 1955–1965.

[4] Mohammad Shadid, Mohamed Badawi & Abedelnasser Abulrob (2021) Antisense oligonucleotides: absorption, distribution, metabolism, and excretion, Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 17:11, 1281-1292

[5] Takakusa H, Iwazaki N, Nishikawa M, Yoshida T, Obika S, Inoue T. Drug Metabolism and Pharmacokinetics of Antisense Oligonucleotide Therapeutics: Typical Profiles, Evaluation Approaches, and Points to Consider Compared with Small Molecule Drugs. Nucleic Acid Ther. 2023 Apr;33(2):83-94. doi: 10.1089/nat.2022.0054. Epub 2023 Feb 3. PMID: 36735616; PMCID: PMC10066781.

[6] Kim J, Basiri B, Hassan C, Punt C, van der Hage E, den Besten C, Bartlett MG. Metabolite Profiling of the Antisense Oligonucleotide Eluforsen Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Sep 6;17:714-725. doi: 10.1016/j.omtn.2019.07.006. Epub 2019 Jul 22. PMID: 31422288; PMCID: PMC6704339.

[7] Crooke RM, Graham MJ, Martin MJ, Lemonidis KM, Wyrzykiewiecz T, Cummins LL. Metabolism of antisense oligonucleotides in rat liver homogenates. J Pharmacol Exp Ther. 2000 Jan;292(1):140-9. PMID: 10604941.

[8] Basiri B, Xie F, Wu B, Humphreys SC, Lade JM, Thayer MB, Yamaguchi P, Florio M, Rock BM. Introducing an In Vitro Liver Stability Assay Capable of Predicting the In Vivo Pharmacodynamic Efficacy of siRNAs for IVIVC. Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Sep 4;21:725-736. doi: 10.1016/j.omtn.2020.07.012. Epub 2020 Jul 10. PMID: 32771924; PMCID: PMC7415771.

[9] Kim J, El Zahar NM, Bartlett MG. In vitro metabolism of 2'-ribose unmodified and modified phosphorothioate oligonucleotide therapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 2020 Jul;34(7):e4839. doi: 10.1002/bmc.4839. Epub 2020 May 7. PMID: 32246854.

[10] Berman CL, Antonsson M, Batkai S, Bosgra S, Chopda GR, Driessen W, Foy J, Hassan C, Hu XS, Jang HG, Meena, Sanseverino M, Thum T, Wang Y, Wild M, Wu JT. OSWG Recommended Approaches to the Nonclinical Pharmacokinetic (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion) Characterization of Therapeutic Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 2023 Aug 17. doi: 10.1089/nat.2023.0011. Epub ahead of print. PMID: 37590469.