体外谷胱甘肽结合模型的研究策略和应用

在种类繁多的药物作用机理中，共价抑制机制这一新的设计理念逐渐被得到了重视和利用，并且在抗癌、抗病毒、糖尿病等多个领域内显现出了非共价结合药物难以匹及的优势，如疗效更为持久、治疗剂量更低等、不易产生耐药性等。

药物靶点大多数都是蛋白质具备亲核性，因此可以作为一个优良的亲核体，与具有亲电活性的基团发生作用，形成共价键，从而作为靶向抑制剂去发挥作用。共价抑制剂的蛋白靶点主要集中在半胱氨酸簇上，而广泛存在于人体各组织器官中的谷胱甘肽（Glutathione, GSH）中因含有半胱氨酸及其巯基结构引起研究人员的注意，常被用于评估共价抑制剂的“弹头”活性。因此建立GSH化学结合评估模型有助于化合物精准靶向远端的半胱氨酸；另一方面，一旦体内药物与靶蛋白作用达到饱和后，药效更多的是依赖于靶蛋白的代谢周期，多余的游离药物需要快速的从体内被酶清除掉以避免和其他靶点蛋白结合，从而避免“脱靶效应”，减少毒副作用发生。因此在共价抑制剂药物研发中，评估游离的共价化合物是否具备在体内被代谢酶清除的能力也显得尤为重要。因此本文将介绍GSH的两种反应模型，即化学结合模型与酶促结合模型，通过阐述其性质、评估策略及应用方向为共价抑制剂及其新药的开发提供参考。

一、GSH的结构及功能

1.1 GSH的结构

GSH是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽化合物，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。GSH有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下，还原型GSH占绝大多数。还原型GSH的分子式为C₁₀H₁₇O₆SN₃，其化学结构式见图1^[1]。GSH几乎存在于身体的每一种细胞组织中，尤其在动物的肾脏、肝脏、红细胞中含量丰富，浓度为0.5-10 mM^[2]。

图1. 还原型GSH的化学结构式^[1]

1.2 GSH的功能及在研发中的重要性

GSH在大多数的生命活动中发挥着重要的作用，不仅可以维持机体的氧化还原平衡、参与细胞的抗氧化反应、整合解毒作用，而且在调节细胞增生、机体免疫应答以及在神经系统中充当神经调质和神经递质中发挥重要的功能 ^[3-6]。

在共价化合物药物研发中，通常利用GSH的巯基活性基团，模拟靶蛋白巯基，研究其与共价化合物的亲和性，即非酶作用下的化学结合能力，从而用于活性化合物的筛选。 除此之外，关于GSH的研究，最常见的集中在GSH的解毒功能上，其主要原理是还原型GSH与体内的自由基结合可以使其转化为可代谢的酸类物质，同时也可以加速自由基的排泄和保护器官避免受到损伤，从而达到解毒的功能。另外还原型GSH还可以参与羧甲基和转丙氨基反应，从而达到保护肝功能的生理作用^{[4, 5]}。因此为了减轻肿瘤药物造成的肝损伤，常将化疗药物与GSH进行联用，一方面降低化疗药物的毒副作用，另一方面起到保护病人肝脏的作用。这种解毒功能的基础主要是由于GSH中半胱氨酸的侧链基团上具有一个活性巯基。该特点也常被用于评估体内未与靶蛋白结合的游离共价化合物是否具备被体内谷胱甘肽转移酶清除的能力，从而作为该类化合物的安全性评价的重要依据之一。

二、GSH化学结合模型的建立及其应用

2.1 GSH化学结合模型的建立

我们经过一系列验证，成功建立了体外评估GSH与化合物的非酶结合（化学结合）的研究模型。其方法为在缓冲液中加入GSH工作液配制成一定浓度的反应体系，在37℃条件下，经过一系列不同时间点的孵育，检测化合物的剩余量，通过各时间点的化合物的剩余率，计算化合物被GSH结合后的消除半衰期；在检测中，同时通过“M+307”作为结合产物可能的检测通道辅助判断化合物与GSH的结合能力。

为了验证方法的可行性，选择已上市共价抑制剂阿法替尼（Afatinib，用于肺癌）和依鲁替尼（Ibrutinib，用于淋巴瘤）作为测试化合物，采用该方法评估其与靶蛋白的亲和能力。结果如图2所示。Afatinib与GSH的结合速率较快，半衰期为22.5分钟，而Ibrutinib的结合速率相对较慢，半衰期为331分钟。据文献报道^[7]，Afatinib在与GSH反应60分钟内浓度就已经下降到初始浓度的29%左右，而Ibrutinib与GSH的结合要在长时间点中才能观察到浓度的降低，这与我们如图的实验结果是完全一致的。通过二者结果的对比，充分证明了我们所建立的GSH化学结合反应实验体系的可行性。

图2. Afatinib和Ibrutinib 分别与GSH的化学结合

2.2 GSH化学结合模型的应用

2.2.1 筛选共价抑制剂的活性“弹头”

共价抑制剂为作为一种具有亲电基团的小分子化合物，其亲电基团能与靶点蛋白结合，从而抑制其生物功能或使其靶向降解，其作用原理如图3所示^[8]。

图3. 共价抑制剂结合原理^[8]

共价抑制剂往往都含有丙烯酰胺、β-内酰胺等亲电官能团，能与靶蛋白中特定的氨基酸残基发生化学反应，形成共价键。丙烯酰胺能够与靶蛋白上的半胱氨酸簇共价结合，所以常作为亲电基团引入到共价抑制剂的结构设计中。如表1，来那替尼（Neratinib）、达可替尼（Dacomitinib）和泽布替尼（Zanubrutinib）都是近年来FDA批准的含有丙烯酰胺的共价抑制剂。

表1. 三种含有丙烯酰胺的共价抑制剂

由于共价抑制剂的活性是治疗成功与否的关键，既不能活性太强导致脱靶也不能活性太弱无法结合。为了合理的筛选共价抑制剂的活性，可以利用GSH上含有半胱氨酸巯基的小分子来模拟体内靶蛋白上的巯基，通过我们建立的GSH reaction实验模型来评估丙烯酰胺等这类共价抑制剂的弹头活性。

2.2.2 指导同一系列化合物亲和力的比较

根据GSH的化学结合模型能够获得化合物与GSH结合的半衰期，该数据可用于结构类似化合物间的亲电能力比较，从而能够指导先导化合物的结构修饰以及优化。如图4所示，化合物E、F、G、H是四个结构类似物，通过我们实验结果证明该系列四个化合物与GSH的结合情况有明显的差异，该结果能够为化学家在筛选活性化合物阶段提供科学依据。

图4. 结构类似化合物与GSH的化学结合比较

2.2.3 指导非酶结合调控下的解毒途径研究

非酶结合能够协同机体解毒，如氨基偶氮染料MAB能够氧化脱水与GSH化学结合形成偶联物实现解毒作用，见图5^[9]。虽然这种完全非酶结合的解毒途径在生物体内并不是主流，但是在本案例中的结合产物高达总胆道偶联物的20%，说明研究化合物的非酶结合对探究化合物的代谢途径不可或缺。

图5. MAB的体内非酶代谢途径^[9]

以上阐述了我们所建立的GSH化学结合模型及其应用，通过该模型，有助于筛选与靶蛋白具备一定亲和力的共价化合物。当化合物在体内与靶蛋白结合后，其游离的化合物需要被快速的清除，从而避免脱靶效应，因此需要建立这类化合物被代谢酶清除的能力的研究模型来评估化合物。下面我们再具体阐述GSH酶促结合模型的评估策略以及如何与GSH化学结合模型共同指导新药的研发。

三、GSH的酶促结合模型及其应用

3.1 谷胱甘肽转移酶的结构

谷胱甘肽转移酶（Glutathione transferase，GSTs）是广泛存在于人类细胞中的蛋白超酶家族，以主要亚型酶GSTA1为例，其结构见图6^[10]。GSTs主要分成三类：胞质GSTs（cytosolic），线粒体GSTs（mitochondrial）和微粒体GSTs（microsomal）。胞质GSTs 是目前最常用的研究体系，胞质GSTs是由两个亚基构成的同源或异源二聚体，每个亚基分子量约为23kDa~30kDa，由199~244个氨基酸组成，亚基的不同组合形成多种GSTs亚型，主要亚型有Alpha、Mu和Pi，详细亚型分类请见表2^{[11, 12]}。

图6. GSTA1结构图^[10]

表2. GSTs的亚型分类^{[11, 12]}

3.2 GSTs的功能及在研发中的重要性

GSTs能通过不同方式在机体内参与调节，对药物代谢和疾病治疗产生影响。具体体现在如下几个方面。GSTs的最主要功能首先就是催化内源或外源物质与GSH进行结合，达到代谢和解毒的功效，见图7^[13]。其次，GSTs能够参与细胞通路的调控，与受体结合抑制JNK信号通路，调控细胞的凋亡，如图8所示^{[14, 15]}。除此之外，GSTs能协同多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associatedproteins，MRP）^[4]的作用将GSH共轭物排出体外，GSTs还参与到如类固醇和前列腺素的生物合成^{[15, 16]}以及酪氨酸分解代谢等生物过程中^[17]。

由于很多化疗药物例如马法兰、顺铂、共价抑制剂等都是GSTs的底物，我们希望这些药物能够在保证药效的情况下，对健康细胞的损伤降到最低。所以针对GSTs的研究主要分成两个方向，一方面就是筛选出能够被GSTs代谢的化合物，利用GSTs的解毒功效降低化疗药物的毒副作用，但另一方面GSTs在很多肿瘤细胞中会有过表达情况的，我们希望筛选出代谢适中的化合物, 保证药效得以发挥。因此，GSH的酶促结合反应的建立，将会为化合物在体内的安全性以及药效方面的评估提供指导与帮助。

图7. GSTs酶作用原理^[13]

图8. GSTs酶调控细胞通路原理^{[14, 15]}

3.3 GSH酶促结合模型的建立及评估策略

我们经过一系列验证成功建立了体外评估GSH酶促结合模型。在评估GSTs代谢稳定性实验中，以肝胞质作为孵育体系，分别选择4-硝基卞氯（p-Nitrobenzoyl chloride, PNBC）和利尿酸（Ethacrynic acid, EA）作为GSTs的底物和抑制剂^[18]。

肝胞质中，PNBC的代谢在含不同浓度抑制剂的条件下有明显的差异，如图9所示。

图9. 人肝细胞胞质中的EA浓度筛选

化合物在肝胞质中经过一系列时间的孵育，通过比较在含和不含抑制剂条件下的化合物的代谢趋势从而判断化合物是否是GSTs的底物。在该验证条件下，底物PNBC的半衰期为17.4分钟，而文献中的半衰期为15分钟，可见相关验证数据与文献中的数据^[19]高度一致，说明我们所建立的GSTs代谢稳定性实验方案是可行的。

以化合物A为例，如图10所示，在不含有EA的孵育体系中，化合物A的半衰期为18.7分钟，在加入EA的孵育体系中半衰期大于145分钟，清除速度有明显的降低，说明化合物A是GSTs的底物。

图10. 人肝细胞胞质中化合物A的代谢

当然，尽管GST家族成员起源于同一祖先，但随着基因复制、重组和突变的累积，不同类别的GSTs亚型在催化活性发挥上又表现出底物特异性和功能多样性^[20]。因此药物代谢在不同个体中可能表现出差异，如果想进一步判断是哪一种亚型进行代谢的，可以采用重组酶的方式进行验证。我们能够提供包括GSTA1、GSTM1和GSTP1三种主要重组酶亚型的代谢稳定性评估策略。

四、GHS化学结构及酶促结合模型在新药研发中的综合应用

GSH化学结合及酶促结合模型统称为GSH结合模型，利用该模型，能让我们更精确解读共价化合物研发中的相关数据，我们已经成功建立了高通量、自动化的GSH结合研究模型，为化学家快速、高效的提供数据支持。

案例解析

图11是哌嗪类似物的结构式^[21]，因其能够抑制KRAS致癌基因常被人们用于共价抑制剂的开发。由于哌嗪类似物上也含有丙烯酰胺，能够与GSH结合，所以研究人员将多个不同结构的哌嗪类似物进行GSH的化学和酶促结合能力的评估，如图12^[21]，横坐标代表化合物化学结合的半衰期，纵坐标代表化合物的酶促反应半衰期。研究的目标经推测应该聚焦在左上角高亮标出的这部分化合物，因为这部分化合物不仅具有和GSH结合的化学活性，同时也能在发挥GSTs解毒能力时不会太快被代谢。通过该筛选方法，研究人员已经筛选出全新的KRAS抑制剂MRTX849，其结构式见图13^[21]，抑制效果能够高达94%，有望上市成为第二款KRAS抑制剂。之后我们采用商品化合物MRTX849进行了一系列验证，其测试结果在图中的推测范围内。

图11. 哌嗪类似物结构式^[21]

图12. 多种哌嗪类化合物的酶促与化学结合能力的综合评估^[21]

图13. MRTX849结构式^[21]

结语与展望

综上所述，化合物与GSH的非酶结合与酶促结合的综合评估能够同时考察共价化合物的亲电性及代谢情况，可以更好的解读化合物的性质，为化学家提供指导。目前越来越多研究共价抑制剂的化学家们会选择同时进行GSH reaction实验以及GST酶的代谢稳定性实验，在评估化合物“弹头”活性的同时评估化合物在体内的清除能力以筛选具备合适的反应性和选择性以及安全有效的化合物。所以GSH结合模型的建立可以评估化合物的活性和安全性，对共价化合物的研发具有非常重要的指导意义。

迄今为止，共价抑制剂研究的靶向氨基酸代表结构如表3所示^[22]，主要研究的结合位点还集中在半胱氨酸簇上。

表3. 针对特定氨基酸的共价基团分类^[22]

我们也在不断探索新的结合位点结合能力评估模型，其中赖氨酸由于其蛋白质结合位点更多且细胞外也有位点存在，很有可能成为下一靶向氨基酸的研究热点，但赖氨酸的亲电性较低，建立赖氨酸结合实验更具有挑战，我们实验室目前正在建立该方法。

相信随着众多开发与评价共价抑制剂的策略的提出与改进，共价抑制剂必将迎来蓬勃发展并为人类疾病的治疗带来新的希望。

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作者：罗亦歆，秦雷磊，王翔凌，陈根富

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟