随着制药技术的不断发展，治疗疾病的药物种类和给药方式越来越多，而口服药物因其较好的顺从性、且具有经济、安全和剂型丰富等优点，在临床给药方式中一直占据主导地位[1]。对于口服药物而言，药物的吸收和生物利用度是研发人员关注的焦点之一。口服药物肠道的吸收研究对评价药物的生物利用度、改进药物剂型和提高疗效具有非常重要的意义。
口服药物肠道吸收的研究方法主要包括体内法、体外法和在体法。相对于其他方法，在体法具有一定的优势，比如，可以保证了肠道神经的完整性以及血液和淋巴液的供应，使得待考察组织的生物活性大大提升，并可以较为准确地反映药物在肠段的真实吸收情况，主要应用于肠膜渗透性研究[2]。本文将主要介绍的在体单向肠灌流模型（single-pass intestinal perfusion, SPIP），是FDA认可的可用于研究药物吸收的模型之一。以下将从SPIP模型与体外、体内法的对比，SPIP模型介绍及验证数据以及SPIP的应用等方面进行介绍，并结合文献报道分享模型的总结和见解。
一、药物肠道吸收的影响因素及常用研究方法
溶解度和渗透性是口服药物在肠道吸收的基础[3, 4]。Amidon[3]等人于1995年提出了生物药剂学分类系统（BCS），将药物分为四类：Ⅰ类（高溶解性高渗透性）、Ⅱ类（低溶解性高渗透性）、Ⅲ类（高溶解性和低渗透性）、Ⅳ类（低溶解性和低渗透性）。其中，药物的溶解性可通过制剂等方式进行改善。药物的渗透性是药物分子的一种特性，其不受溶媒或产品的工艺变化所影响，因此，对于BSC Ⅰ类和Ⅲ类的高溶解性的药物来说，对于肠吸收过程中的渗透性研究就显得尤为重要。渗透性可根据药物在肠道处的吸收程度或根据药物的跨肠膜质量转移速率直接测定；也可以通过评估药物在药代动力学研究中的吸收程度和静脉途径给药的参比剂量进行比较来间接测定药物的渗透性[5]。
口服生物利用度（F）是一个具有相对意义的术语，用于描述口服给药后与参考途径（通常是静脉快速注射）给药后吸收的速率和程度的相对比值。一般认为，口服生物利用度F=Fa*Fg*Fh，其中Fa是药物口服后被吸收进入肠上皮细胞的药物比例；Fg是逃逸肠道代谢的药物比例；Fh是逃逸肝脏代谢的药物比例。
图1. 口服生物利用度计算过程模拟[6]
DMPK在肠道吸收中的研究方法，主要有体内法（in vivo）、体外法（in vitro）和在体法（in situ）：
01 体内法
通常设置静脉注射给药(I.V.)组和口服给药(P.O)组，可以通过I.V.清除率和理论肝血流速，得到只通过肝脏代谢的药物完整肠道吸收比例：Fa*Fg=F/Fh=[(AUCpo, 0-∞/AUCiv, 0-∞)*( Doseiv/Dosepo)]/(1-CLb/Qh)
通过肝门静脉和颈动脉插管，得到更准确的药物在完整肠道中吸收比例参数：Fa*Fg=Qpor*Rb*(AUCpor-AUCsys)/dose
02 体外法
常见的有Caco-2细胞培养法和Ussing Chamber，其中，Caco-2细胞是人结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，通常用来模拟体内肠道转运实验，因此，是目前体外研究肠吸收的最常用方法之一。Ussing Chamber的可控性强，通量大，可以实时检测肠道的活性和完整性，适合用来快速测定药物肠道的渗透性。
03 在体法
常见的有SPIP模型。SPIP模型是在麻醉大鼠上，选择目标肠段如回肠段的两端进行结扎插管，通过恒定流速进行灌流，通过肠段两端的进出口浓度变化，分析药物在肠道中的吸收情况。同时，可以在目标回肠段的肠系膜静脉处结扎插管采血，以更好反映药物是被吸收入血或被肠道代谢或被吸附于肠壁中。
图2. SPIP手术示意图[7]
SPIP模型具备以下特点：
提供了完整的血液供应和功能性肠屏障；
保留了小肠的生理特征，例如由经细胞旁路转运途径、在体介导的转运；
通过肠系膜静脉插管采血和肠腔出口取样，维持了药物的漏槽条件，并且排除了肝首过效应以及观察药物在肠壁组织中的代谢；
技术成熟、可控性强，便于在试验中控制药物的浓度、pH值、灌流的速度以及灵活的选择目标肠段，能较为准确地反映药物在肠道的吸收情况。
在上述三种方法中，体外法无法模拟正常的生理特性，体内模型虽最具有临床相关性，但其包括可能影响吸收和生物利用度的所有生理因素，因此仍不足以对针对性地对肠道吸收机理进行相关研究[8]。在体法SPIP作为FDA指南建议的模型工具，可以对基于BCS的药物渗透性特征进行分类，并且该方法可应用于口服给药药物的生物等效性豁免目的，具有良好的推广应用前景。
二、SPIP模型建立及验证数据
SPIP概述及模型建立方法
自1950年以来，陆续有大量研究者对肠道吸收方向进行了研究报道。1963年，Jocobs等[9]人设计了SPIP系统，研究了氨基酸通过肠吸收途径进入体循环的过程。自此之后，SPIP在肠道吸收方面的研究被越来越多的人所关注。SPIP的手术过程如图2所示，本文所建立的SPIP模型方法中，考虑到药物浓度对实验结果的影响，在进行一系列设置不同浓度梯度的验证实验后，结果显示当对某一未知药物进行研究时，浓度不宜设置过高，并且在采样时，可以在进口管路中进行多点采样，以避免由于药物与管路之间可能存在的非特异性吸附而引起的结果偏差。
SPIP参数介绍
与人体肠道相似，大鼠的肠道也会分泌或吸收水分。通常用稳态时净水流量（the net water flux, NWF）来表征肠道中水分的变化[10]。利用酚红对出口灌流液校正，得到因水分变化引起的药物实际出口浓度(Ci)以及吸收分数Fa值[11, 12]。
通过SPIP模型可以得到最主要的两个参数：有效渗透系数Peff值以及表观渗透系数Pblood值。
上式中，当NWF<0时，表示肠道吸收水分；当NWF>0时，则表示肠道分泌水分；
其中，CPRin和CPRout分别表示酚红在目标灌流肠段中的进出口浓度；Qin是灌流速度；Cin和Cout分别表示药物的进出口检测浓度；l表示目标肠段的长度；r表示目标灌流肠段的半径；ΔMb/Δt表示稳态条件时，药物在血中单位时间透过的量；<C>表示理论上腔体中药物的平均浓度。
通常情况下，我们认为当Peff<3×10-6 cm/s时，则表示药物难被吸收；当Peff>20×10-6 cm/s时，则表示药物易被吸收[13]。
验证数据拟合
通过基于BCS中用于说明渗透性实验适用性的推荐药物中，选择如表1所示的8种化合物进行SPIP研究，其验证实验结果与文献参考值基本一致。
表1. 药明康德DMPK验证数据与文献数据[14]比较
与此同时，对部分数据与文献中被报道的人的Peff值进行拟合，发现大鼠的Peff值和人的Peff值具有良好的相关性，同时将大鼠的Peff值和Caco-2数据进行拟合后，发现也存在相关性。这些实验结果表示SPIP模型平台建立成功，并具有良好的人体预测性。
图3. 大鼠SPIP法测得Peff与人体的Peff数据拟合
图4. 大鼠SPIP法测得Peff与Caco-2 Papp数据拟合
三、SPIP的应用
3.1 生物等效豁免及渗透性分级鉴定
在进行仿制药研究时，需要证明仿制药与原研药的治疗等效性，治疗等效性需要由药学等效和生物等效进行说明， SPIP主要涉及生物等效方面的生物等效性豁免。
在《人体生物等效性试验豁免指导原则》中，对生物等效豁免的定义如下：当口服固体常释制剂在体内的溶出，相对于胃排空时间非常快，并且具有很高的水溶性时，药物的吸收速率和吸收程度不会依赖于药物的溶出时间或在胃肠道中的通过时间。因此，在这种情况下，对于BCS I类和III类的药物，处方中的其他辅料成分对API的吸收无显著影响，可通过SPIP、Ussing chamber或Caco-2等方法验证仿制药与原研药渗透一致性，从而不必再进行体内生物等效性试验，即生物等效性豁免。
表2. 高-中-低渗透性常用参考药物[5]
当在高-中-低渗数据库及系统比较完善的情况下，可以对被测药物的渗透性进行分级，以BCS推荐的渗透性参考药物作为对照品，与待测药物的渗透性检测值比较，对待测药物进行渗透性评级。
不同肠段及不同剂型的吸收与机理研究
与体内体外法相比，在体法SPIP模型已适用于药物主要吸收肠段的确认，以及不同剂型配方对药物肠道吸收的影响等方面的研究。例如，对于同一药物，不同肠段部位药物吸收情况也可能有很大差异。采用不同肠段在体灌流研究，通过各肠段的Peff结果比较，从而判断药物在肠道的主要吸收部分。与此同时，同一药物的不同剂型可能存在肠吸收差异，通过对比不同剂型的吸收情况，有助于不同药物制剂类型的筛选。
另外，由于肠上皮细胞内转运蛋白的存在，不同种类的药物在肠吸收方式各有所不同，因此，在灌流液中可以加入P-gp或MRP等转运体的抑制剂或底物，可研究涉及肠道转运的吸收以及吸收的药物与药物之间的相互作用。
图5. 大鼠不同肠段SPIP示意图[15]
结语
肠道吸收是大多数口服药物的主要吸收途径，BCS指出了药物在胃肠道中的溶解性和渗透性是决定药物吸收程度的关键因素，SPIP模型是研究口服药物在体渗透性的有效工具。药明康德DMPK已经成功的搭建了SPIP测试平台，具备良好的人体预测性，可以评估药物的渗透性以及对其进行渗透性分级测定，并已用于不同肠段及不同剂型的吸收评估等研究。SPIP模型对研究药物在肠道中的吸收，改善口服药物的生物利用度、给药剂型等方面具有重要的指导意义，助力口服药物的研发进程。
药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。
点击此处可与我们的专家进行联系。
作者：任想，焦桴荣，董轩，冯全利，汤城
编辑：方健，钱卉娟
设计：倪德伟
参考
[1] Balimane PV, Chong S, Morrison RA. Current methodologies used for evaluation of intestinal permeability and absorption. J Pharmacol Toxicol Methods. 2000;44(1):301-312.
[2] 罗轶凡,任利翔,李晓红, et al.药物肠道吸收研究方法概述.药物评价研究, 2017; 40(05):706-710.
[3] Amidon GL, Lennernäs H, Shah VP, et al. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm Res. 1995;12(3):413-420.
[4] CDER/FDA, Guidance for industry waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate-release solid oral dosage forms based on a biopharmaceutics classification system, Cent. Drug Eval. Res. (2000).
[5] Dezani TM, Dezani AB, Junior JB, et al. Single-Pass Intestinal Perfusion (SPIP) and prediction of fraction absorbed and permeability in humans: A study with antiretroviral drugs. Eur J Pharm Biopharm. 2016;104:131-139.
[6] Parodi A, Buzaeva P, Nigovora D, et al. Nanomedicine for increasing the oral bioavailability of cancer treatments. J Nanobiotechnology. 2021;19(1):354.
[7] Li H, Dong L, Liu Y, et al. Comparison of two approaches of intestinal absorption by puerarin. J Pharmacol Toxicol Methods. 2014;70(1):6-11.
[8] López-Yerena A, Pérez M, Vallverdú-Queralt A, et al. Oleacein Intestinal Permeation and Metabolism in Rats Using an In Situ Perfusion Technique. Pharmaceutics. 2021;13(5):719.
[9] JACOBS FA, TARNASKY WG, FORKS G. Primary and secondary transport systems for amino acids in the intact intestine. JAMA. 1963;183:765-767.
[10] Nagare N, Damre A, Singh KS, et al. Determination of site of absorption of propranolol in rat gut using in situ single-pass intestinal perfusion. Indian J Pharm Sci. 2010;72(5):625-629.
[11] Cummins CL, Salphati L, Reid MJ, et al. In vivo modulation of intestinal CYP3A metabolism by P-glycoprotein: studies using the rat single-pass intestinal perfusion model. J Pharmacol Exp Ther. 2003;305(1):306-314.
[12] Xie YS, Ren XL, Pan GX, et al. The assessment of absorption of periplocin in situ via intestinal perfusion of rats by HPLC. Biomed Chromatogr. 2008;22(2):196-201.
[13] Yao Y, Mi W, Cao G, et al. The Absorption Characteristics of Nonvolatile Components in a Water Extraction From Amomi fructus as Determined by In Situ Single-Pass Intestinal Perfusion and High-Performance Liquid Chromatography. Front Pharmacol. 2020;11:711.
[14] Dubbelboer IR, Dahlgren D, Sjögren E, et al. Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations. Eur J Pharm Biopharm. 2019;142:364-376.
[15] Sun W, Gao J, Fan R, et al. The Effect of Particle Size on the Absorption of Cyclosporin A Nanosuspensions. Int J Nanomedicine. 2022;17:1741-1755.
加入订阅
获取药物代谢与药代动力学最新专业内容和信息
