One mouse One PK系统助力生物药DMPK研究

简单而言，生物药是一类利用现代生物技术方法生产的源自生物体内并被用于疾病的诊断、治疗或预防的生物大分子，包括重组多肽/蛋白，核酸，抗体类大分子，甚至细胞等。与传统小分子药物相比，生物药具有相对分子量大，结构复杂、不易透过生物膜、给药剂量低和易在体内降解等特点。随着生物技术的迅猛发展，生物药已被广泛用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病和代谢性疾病等多种疾病。生物药，特别是单抗药物，双特异性抗体药物，ADC药物，寡核苷酸药物，以及CAR-T/NK等细胞治疗药物近年发展迅猛。2018年全球销量最高的10个药物中有9个是生物药，包括7个单抗体药物和2个融合蛋白药物^[1]。从中国研发市场来看，同样非常火爆，2021年CDE受理1类生物制品创新药注册申请744个，较2020年336个有明显大幅上升^[2]。

随着生物药研发市场的日渐火爆，各种新分子类型和新靶点的生物药层出不穷，这对于药物的临床前研究提出了更高的要求。特别是当药物靶点只存在人中（即受试药物在动物中没有药理学活性），如何选择合适的相关动物种属完成临床前药代动力学研究（Pharmacokinetics, PK）显得尤为重要。在实际研究中，转基因动物模型（特别是转基因小鼠）的应用越来越多，但是受限于传统小动物实验和分析手段（传统ELISA）的局限，通常都有动物消耗量大，成本高，实验数据波动大等问题。针对上述的困难与痛点，我们推出了One mouse One PK系统，我们将从以下几个方面介绍。首先将介绍生物药临床前研究动物种属的选择的一些原则和法规指导，以及转基因动物模型应用的案例；接着将介绍传统小鼠ELISA实验的痛点，以及我们的One mouse One PK系统的优势；最后将展示一个曲妥珠单抗（Trastuzumab）给药CD-1小鼠的验证实验，体现One mouse One PK系统的稳健性（小鼠间PK曲线）以及定量准确性（Micro-ELISA平台和传统ELISA平台头对头的比较）。

一、生物药临床前研究动物种属的选择

生物药临床前研究中的一个重要的环节就是相关动物种属的选择。所谓相关动物种属是指受试物在此类动物体内由于受体或抗原决定簇的表达，受试物表现出药理学活性。可以使用多种技术（如免疫化学或者功能试验）确定相关种属^[3]。例如用于单克隆抗体试验的相关动物种属应能表达所预期的抗原表位，并能证明其与人体组织具有类似的组织交叉反应。这将显著提高评价与抗原决定簇结合和任何非预期组织交叉反应所致毒性的能力。生物药的生物活性往往具有种属和/或组织特异性，采用相关种属进行非临床研究有助于阐明其药理学和毒理学特征^[4]。如下表1列举了各个法规对于相关种属选择的描述与建议。

表1. 各法规对于相关种属选择的描述和建议

参考《ICH S6(R1) 生物技术药物的临床前安全性评价》，安全性评价项目中一般应包括两种相关种属的动物，如只能确定一种相关种属的动物或对该生物药物的生物学活性已十分了解，一种相关种属也可能满足要求。不相关动物种属的毒性试验可能会产生误导，因而不鼓励使用。当无相关种属时，应考虑使用表达人源受体的相关转基因动物或者使用同源蛋白进行研究。参考《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》，药代动力学研究在考虑与人体药代动力学性质相关性的前提下，尽可能选择与毒理学和药效学研究相同的动物^[5]。参考这些原则，在实际的临床前毒理和药代动力学研究中，对于无法找到合适相关种属的受试药物（例如对于单克隆抗体药物，没有动物种属可以表达类似抗原决定簇），可以采用转基因动物模型（通常是转基因小鼠）来完成。近年来，与人疾病相似的动物模型开发取得了很大进展。这些动物模型包括诱发的和自发的疾病模型、基因敲除和转基因动物。这些模型不仅对明确产品的药理作用、药代动力学特征和剂量选择提供进一步的认识，也有助于确定安全性（如评价疾病进展的不良促进作用）。

二、转基因动物模型助力生物药临床前研究

当某些生物药可能无法找到合适的临床前实验相关动物种属时，可以考虑使用转基因动物模型（通常是转基因小鼠）来完成动物实验，药代动力学评估上更贴近于人体内的真实情况且更加准确。以下从三个典型应用场景进行介绍：

药物靶点只存在于人种属中

在一个双特异性单链抗体（bi-scFv）的研究中，该抗体靶向hEGFRvIII以及T细胞上的人源 CD3ε（不与其他种属的CD3反应），为了更加准确的预测其在人体内的药代动力学情况，在临床前PK研究中使用了人CD3转基因小鼠作为动物模型，药代动力学研究发现血浆和全血中的hEGFRvIII:CD3 bi-scFv的初始半衰期为~8分钟，终末半衰期为~2.5小时。并且在该人CD3转基因小鼠中移植高侵袭性小鼠胶质瘤后给予药物，延长了生存期并获得长期治愈。这部分数据被用于IND申报中^[6]，帮助了这个药物快速进入临床研究阶段。

转基因疾病模型评估抗感染药物的药代动力学研究

一个抗SARS-CoV-2的中和抗体在药代动力学药效学研究上，使用表达人源ACE2受体的小鼠模型（K18-hACE2转基因小鼠），考察中和抗体药物MD65对于感染SARS-CoV-2的K18-hACE2小鼠的保护以及其药代动力学特征^[7]。研究发现MD65在K18-hACE2小鼠致命感染模型中具有很好的保护效果，这些都一定程度证明了MD65在拯救严重COVID-19感染的生命的治疗价值。

人源化抗体类药物半衰期和清除速率的准确评估

另外一个在药物研发中广泛应用转基因动物模型的案例是，应用人源化FcRn小鼠评估抗体类药物（具有FC端）半衰期和清除速率的研究。对于抗体类药物，半衰期和清除速率与该抗体和人新生儿FC受体（neonatal Fc Receptor, FcRn）的亲和力相关。不同动物种属表达的FcRn是不同的，可以通过敲除鼠源FcRn基因，敲入人源化FcRn基因，构建表达人源化FcRn蛋白的小鼠。有一项研究表明通过测试15种单克隆抗体（嵌合体，人源化或者全人源抗体），这些抗体的CL（清除速率）在表达人源化FcRn的Tg32小鼠模型中与人体内的CL值高度相关（r² = 0.83, p < 0.01），其相关性显著高于NHP（非人灵长类）与人体内的CL值相关度（r² = 0.67, p < 0.01）（图1）。这些研究表明在药物发现和临床前药物开发中采用表达人源化FcRn的Tg32小鼠模型来预测人类的CL，可能会在整体上减少猴子在PK研究中的使用，帮助先导分子的早期选择，并最终加速候选药物进入临床阶段^[8]。

图1. 啮齿动物与人类和NHP与人类的mAb CL的相关性。

(A) WT小鼠CL与人类CL的线性相关图（11种mAB），(B) NHP CL与人类CL的线性相关图。

(C) Tg32半合子CL与人类CL的相关图，(D) Tg32全合子CL与人类CL的线性相关图。

B、C和D图使用相同的15种mAB进行测试。

三、传统小鼠PK/PD研究的痛点

如上介绍，在药物研发中转基因小鼠有着非常广泛的应用，并且可以预见随着对疾病分子机理和信号通路调节的理解更加深入，会有越来越多的转基因模型小鼠和疾病模型小鼠应用在药物发现和临床前研究中。而这些研究通常都会涉及到生物分析的需求，对于大分子药物特别是抗体类药物通常是通过LBA平台进行分析（可以参见之前的公众号文章：基于LBA技术的抗体类药物临床前PK生物分析策略与路径）。基于LBA（主要是ELISA）的生物分析通常对于样品体积的需求比较大，为了满足上样量和复测的需求一般每个时间点至少需要30-50uL的血清或血浆。通常一只小鼠只能满足2-3个点的采血需求（符合IACUC动物福利要求）。对于大分子药物，为了绘制一个比较完整的PK曲线用于参数计算，通常至少需要9-10个采血时间点及以上，需要通过多只小鼠交叉采血的方式完成。这就存在小鼠使用量大，交叉数据点波动较大，个体间PK参数差异较大等问题。而人源化转基因小鼠通常价格比较高昂，这进一步增加了研究成本负担。

所以能否使用更少的转基因小鼠完成药代动力学研究？一方面降低成本，另一方面减少交叉采血引起的个体间PK参数差异，同时也更好的满足动物福利3R原则。

这里简单介绍一下什么是3R原则，即实验动物的替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）。替代就是使用低等级动物代替高等级动物，或不使用动物而采用其他方法达到与动物实验相同的目的。减少就是为获得特定数量及准确的信息，尽量减少实验动物使用数量。优化指使用动物时尽量减少非人道程序的影响范围和程度。实验同时，避免或减轻给动物造成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安。动物和人一样，有大脑思维、有喜怒哀乐、有疼痛感、有恐惧感，大自然给予它们同等的生存权利。在实验动物的使用和研究中坚持3R原则，要善待活体动物，减少痛苦和死亡率^[9]。

这个答案是肯定的，我们建立了一套One mouse One PK系统，可以在满足IACUC动物福利的基础上在一个小鼠上完成完整PK曲线的测定。这个系统包括两方面的能力，一方面我们开发了一套基于Micro-ELISA的微量ELISA系统，可以将样本使用量降低至8-10uL，同时可以满足样本分析和复测的需求（两次）。另一方面我们的动物房也建立了基于隐静脉采血的少量多次安全采血方式，在符合IACUC动物福利的基础上，满足密集采血的需求以及避免溶血的可能。

下图比较了一个标准三剂量组的PK实验设计，传统实验设计所需要的小鼠数量和使用One mouse One PK系统的所需小鼠数量，动物使用量上减少了70%以上（图2）。

图2. 传统实验设计和 One mouse One PK系统所需要的动物数量比较，传统实验设计通常每组实验需要4只小鼠的交叉采血，每个剂量组需要6个重复。而One mouse One PK系统每组实验仅需要1只小鼠采血。

四、One mouse One PK系统验证

我们内部验证了One mouse One PK系统，实验使用了6只CD-1小鼠，每只小鼠给予10mpk曲妥珠单抗（Trastuzumab），每个小鼠采集8个时间点，每个时间点采集10uL血浆。每个小鼠相应时间点血浆药物浓度如下（表2），每只动物PK曲线如图3。实验数据可见对于One mouse One PK系统，实验动物间有很好的一致性。

表2. 6只小鼠给药曲妥珠单抗（10mpk剂量），每只小鼠采集0小时（pre-dose），0.5小时，4小时，8小时，24小时，96小时，168小时和336小时的血浆，通过Micro-ELISA平台定量药物浓度，不同小鼠同一时间点的标准差（Standard Deviation, SD）和变异系数（Coefficient of Variation, CV）计算见表最后两列。不同小鼠间体现了很好的一致性。

图3. 将表2数据绘制成PK曲线，不同颜色线代表不同的动物（小鼠M01-M06）的PK曲线，横坐标为给药后采血的小时数，纵坐标为曲妥珠单抗血浆药物浓度（ng/mL）。

为了更好的验证One mouse One PK系统，我们将Micro-ELISA平台和传统ELISA平台进行了头对头的比较，结果发现通过Micro-ELISA平台得到的定量数据和传统ELISA平台得到的定量数据基本完全一致，同样一个样品在两个系统下定量药物浓度偏差Bias均在10%以下，大部分都在5%以下（图4）。可见One mouse One PK系统中Micro-ELISA平台的可靠性和稳定性。并且我们发现Micro-ELISA平台具有与传统ELISA平台相似的检测灵敏度和线性范围。

图4. 曲妥珠给药的动物实验样本分别通过Micro-ELISA平台和传统ELISA平台进行定量分析（6次重复）。两个平台分析使用同样的assay format，捕获试剂: Human Her2, His Tag (MALS verified); 检测试剂：Goat Anti-Human IgG, Monkey ads-HRP。数据通过SoftMax软件回归计算药物浓度，标曲通过4参数逻辑回归拟合，权重因子为1/Y2。横纵坐标注释参考图3。

我们建立了一套基于Micro-ELISA和小鼠微量采血技术的One mouse One PK系统，通过曲妥珠单抗给药CD-1小鼠验证了这套系统，实验动物间有很好的一致性，由于避免了交叉采血，可以显著降低PK参数的组间差异。同时我们验证了Micro-ELISA平台和传统ELISA平台在药物浓度定量上基本完全一致。在获得同样数据质量的前提下，One mouse One PK系统可以显著减少实验动物使用量（~40%-80%），提高数据稳健性和一致性（组间偏差在30%以内），降低成本，同时更符合动物福利3R原则。

结语

药明康德DMPK部门具备丰富的临床前生物分析经验，目前在大分子生物分析上，已承接了大量新分子类型生物药的药代动力学生物分析工作，实现了对主要热门靶点的分析经验全覆盖，并且对于新兴类型药物的生物分析，例如双/多特异性抗体，ADC，抗体片段/抗体前药，寡核苷酸，PEG蛋白/肽段等都积累了丰富经验。可以帮助客户快速完成临床前生物分析方法的建立和确证，满足药代动力学的FDA/NMPA/TGA的IND申报要求。

One mouse One PK系统可以帮助更广泛的应用转基因模型小鼠和疾病模型小鼠在药物发现和临床前DMPK研究中，助力新分子类型/新靶点药物的研发，帮助更准确的评估药物的药代动力学特征，为后续的毒理和临床研究打下坚实的基础。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：周毛天

编辑：李陟昱，邢丽丽，方健，钱卉娟

设计：倪德伟