溶血对分析物的检测有哪些影响？如何解决？

血浆指的是全血在加入抗凝剂并经离心后，将红细胞、白细胞等物质分离获得的上层液体，通常呈淡黄色。血浆是体内药物分析的主要生物基质类型之一。全血采集、血浆制备和分析物性质等因素均可能导致红细胞破裂。在血浆的制备过程中如果红细胞破裂，将产生不同程度的溶血。红细胞破裂会释放出胞内的一些组分，这对于待测分析物的检测分析主要会造成哪些影响，又该如何解决呢？

我们的回答如下：

产生基质效应

溶血会引发糖蛋白、血红蛋白、胆红素和磷脂等物质的释放，这会产生一定的基质效应。可以通过优化液相质谱条件或改变前处理方式来解决此类问题。

影响提取回收率

对于高血红蛋白结合的分析物，溶血会影响其提取回收率。可以通过加入合适的添加剂来提高回收率。

引发稳定性问题

红细胞中特有的酶和血红素因溶血进入血浆中会引发分析物稳定性问题。可以通过调节环境pH条件，加入酶抑制剂、抗氧化剂等添加剂来使酶失效或避免氧化反应。

影响全血-血浆分配比较高或脂质体等特殊分析物浓度检测

这类分析物在红细胞中/包裹态的浓度远高于血浆。因此，一旦产生溶血或者脂质体破裂，将严重影响分析物在血浆中检测的准确。遇到这种情况，应谨慎操作，从源头上避免溶血。

产生溶血的原因多种多样，包括生物体内疾病状态、生理状况变化（如渗透压、pH环境，血浆成分）等内部因素，以及样本收集、转运和储存过程中等外部因素。例如使用小口径采血针时，真空作用易引起红细胞破裂。化学性损伤（如乙醇，柠檬酸等）和一些药物作用（如抗生素类，磺胺类，非甾体抗炎药）也可能导致溶血。图1展示了不同程度的溶血现象，在血浆样品采集制备后，可根据比色卡判断溶血程度^[1]。

图1. 溶血程度比色卡^[1]

溶血发生后，红细胞中的脂膜、酶等生理成分便会进入血浆，这些成分在基质效应、提取回收率、稳定性及其他方面会影响分析物检测的准确性和可靠性。在国际人用药品注册技术协调会ICH协调指导原则 《M10: 生物分析方法验证及样本分析》中，明确了溶血基质的选择性和基质效应考察要求。因此，在方法学验证过程中，我们将通过向血浆基质中加入全血（至少2%，v/v）的方式模拟溶血血浆，并考察溶血基质效应。如果存在溶血基质效应，需要进行方法优化，以确保分析物检测的准确。在本文中，我们将总结几种溶血对分析物的定量有影响的案例以及相应的解决方案。

糖蛋白、血红蛋白、胆红素和磷脂等物质释放可能会产生一定的基质效应，可通过优化液相质谱条件或改变前处理方式，使这些干扰组分与分析物分离。

在基于液相质谱平台的生物分析中，当溶血释放出的组分如糖蛋白、血红蛋白、胆红素和磷脂等物质与分析物在液相中共流出进入质谱，可能会对分析物峰型产生影响，进而对色谱信号产生抑制或增强作用。为解决这类问题，通常会采取以下策略：①改变仪器条件；②更换提取方式；③稀释样品；④减少进样体积等。

例如，阿托伐他汀的氘代内标在溶血血浆中与其干扰峰无法基线分离（图2）^[1]；而奥氮平及其氘代内标在溶血血浆中信号异常低（图3）^[1]，针对这两个案例，可以分别通过优化液相质谱条件以及将提取方式调整为液液萃取来解决。

图2. 阿托伐他汀及其氘代内标在不同液相梯度中的色谱图^[1] 

图3. 奥氮平及其氘代内标经不同前处理方式处理后的色谱图^[1]

高血红蛋白结合分析物在溶血血浆中的提取回收率可能会下降。可通过加入过饱和盐、强酸、强碱或表面活性剂等试剂来占据结合位点，防止分析物和血红蛋白结合，或者破坏蛋白结构使分析物与结合物分离。

例如青蒿素及其衍生物易与红细胞中的血红素结合，可以在蛋白沉淀过程中加入0.2%的曲拉通X-100，这样可保证分析物在常规及溶血血浆中的提取回收率一致。

当溶血发生，红细胞中特有的酶和血红素将进入血浆，可能引发分析物稳定性问题。可通过调节环境pH条件，加入酶抑制剂和抗氧化剂等添加剂，使酶失效或避免氧化反应来解决。

（1）在体内，大多数分析物的代谢过程都需要酶的参与，而这些酶在离体基质中仍可能保持活性，导致分析物降解。另外，红细胞中特有的酶可能会影响部分分析物的稳定性，如表1所示。

表1. 溶血时红细胞释放的酶及其影响的分析物

通常针对这类问题的解决方式包括：①调节环境pH条件；②加入酶抑制剂（如苯甲磺酰氟，蛋白酶抑制剂，敌敌畏）、或抗氧化剂（如抗坏血酸，柠檬酸）等添加剂。

（2）组成血红蛋白的血红素在氧气作用下转化为高铁血红素，其螯合的二价铁被氧化成三价铁，易与分析物中的酚羟基发生反应，生成自由基。这影响了阿片类药物、去氧肾上腺素^[1]、拟肾上腺素等均含有酚羟基结构的物质。

例如，吗啡在接触空气时容易被氧化，生成伪吗啡和吗啡N-氧化物。当吗啡存在于溶血血浆中时，三价铁离子与结构中的酚羟基反应，进一步加剧吗啡的氧化^[4]，如图4所示。为了避免这种氧化反应，通常可以在血浆中加入抗氧化剂来避免氧化反应，如抗坏血酸、柠檬酸。

图4. 吗啡的氧化过程

从源头避免溶血可以减少溶血对全血-血浆分配比较高或脂质体等特殊分析物真实结果的检测所带来的影响。

（1）分析物在全血和血浆中的浓度存在一定分配比例。如果分析物的全血-血浆分配比较高（如甲醋唑胺，环孢素A，吲达帕胺等^[5]），那么在发生溶血现象时，原本分配于红细胞中的分析物会随着溶血逸散到上层血浆中，导致血浆中游离分析物的浓度升高，如图5所示。因此在样品采集过程中，要尽量避免溶血的产生。

图5. 全血-血浆分配比较高的分析物在溶血血浆中的分配情况

(2) 脂质体是一种由磷脂双层分子构成的空隙球结构，其中包裹着游离药物，如果血浆中存在导致细胞膜破裂的条件，脂质体可能会破裂至一定程度，导致包裹的游离药物释放出来，这将严重影响分析物的检测浓度。因此，在脂质体药物的样品采集过程中，需要尽量轻柔操作，避免溶血。

结语

在生物分析工作中，理解并评估溶血的影响是非常重要的，尤其要关注本文提到的因溶血导致的基质效应、提取回收率、稳定性等问题。最理想的解决方案是从源头防止溶血，即在采血、离心等环节注意操作细节以避免溶血发生。如果溶血无法避免，分析人员需要关注溶血现象对血浆基质中分析物的影响，以保证生物分析结果的准确性和可靠性。

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参考文献：

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[2] ICH协调指导原则 《M10: 生物分析方法验证及样本分析》-2022年05月

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[4]Eugénie-Raphaëlle Bérubé, Marie-Pierre Taillon, Milton Furtado & Fabio Garofolo.Impact of sample hemolysis on drug stability in regulated bioanalysis[J]. Bioanalysis, 2011, 3(18): 2097

[5]马欢;葛庆华.特殊基质样品及内源性物质生物分析方法的《中国医药工业杂志》 - 2017年048卷010期

作者：吴睿，高峥贞，卢金莲，张玲玲，邢丽丽

编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹