Non-P450酶介导的代谢研究和体外评估策略

药物代谢是指药物分子被机体吸收后，在酶的作用下发生化学结构转化的过程。药物代谢对药物的药效、毒性及临床合并用药时的药物相互作用等具有重要影响。药物代谢中起重要催化作用的为药物代谢酶，其主要存在于肝脏、肠道和血液中，可以把亲脂性药物转化为更亲水的药物，以促进其从体内排出。药物代谢酶分为一相代谢酶和二相代谢酶。一相代谢酶是参与氧化、还原和水解反应的代谢酶；二相代谢酶主要是参与结合反应的代谢酶^[1]。

下表总结了部分药物代谢酶的名称，组织/亚细胞位置^[1]。

表1. 部分一相药物代谢酶和其组织/亚细胞位置

表2. 部分二相药物代谢酶和其组织/亚细胞位置

作为体内最重要的一相药物代谢酶，细胞色素P450酶参与约75%的药物代谢反应，因此这类酶及相关氧化代谢反应一直是新药研发中关注的焦点，相应的研究技术和评价策略也已趋于成熟。近年来，随着组合化学、高通量筛选等技术的发展，结构新颖的药物层出不穷，Non-P450酶催化的代谢途径逐渐被大家所关注。然而，由于对Non-P450酶催化的特殊代谢途径认识不足，导致临床前实验动物种属选择失误，最终导致临床试验阶段药物被终止开发的案例越来越多。因此在本文中，我们主要介绍Non-P450酶的代谢及体外研究评估策略，为新药开发提供参考。

一、Non-P450酶的重要性

介导药物代谢或生物转化的药物代谢酶在确定药物的吸收、分布、代谢和排泄特性方面起着至关重要的作用。P450家族的药物代谢酶在这方面的整体作用不能被低估，但近年来Non-P450酶介导的代谢领域的研究得到了越来越多的关注^[2]。这可能是为了减少P450代谢，从而引入对P450不敏感的化学基团，从而增加了被Non-P450酶代谢的比例。此外，Non-P450酶代谢对药物治疗作用位点的影响也受到越来越多的关注。

下图列举2006-2015年FDA批准的静注和口服小分子药物中，主要代谢产物分别由P450或Non-P450酶单独或二者共同介导以及无主要代谢产物的各类情况占比^[3-4]。

图1. 2006-2015年FDA批准静注和口服小分子药物的代谢酶参与情况

从图中可以看出，在获得FDA批准的125款药物中，主要代谢过程由Non-P450酶介导的药物占比20.8%，由P450和Non-P450酶共同介导的药物占比为16.8%，因此Non-P450酶代谢占据了非常重要的位置。

下图中，图A展示了2006-2015年各年度药物中主要代谢产物由P450或Non-P450酶介导和无主要代谢产物的三种情况的占比，同样的数据也在图B中以每年药物的数量表示。可以看出，除2010年外，2006年到2015年每年的药物占比中，Non-P450酶占比均不低于25%，其中2008年高达64.6%。以上数据表明Non-P450酶参与的药物代谢在新药研发中占据来越重要的地位。 

图2. 2006-2015年FDA批准静注和口服小分子药物的代谢酶参与占比（A）及数量（B）

Non-P450酶包含一相反应中的水解酶、氧化酶等和二相反应中的结合酶等。本篇文章主要讨论的是一相代谢中主要的Non-P450酶：醛氧化酶（AO），黄嘌呤氧化酶（XO），醛酮还原酶（AKR），黄素单加氧酶（FMO）和单胺氧化酶（MAO）。这五种酶在2005-2016年FDA批准的Top 200的药物中代谢参与率占比约5%，也被越来越多的化学家所重视，成为药物代谢研究的重要研究内容之一^[3-4]。如果临床前研究阶段没有发现这些酶介导的代谢，可能造成不可预见的后果，导致研发终止。

二、醛氧化酶（AO）和黄嘌呤氧化酶（XO）

AO和XO两者具有高度同源性，其在氨基酸序列上具有显著的相似性。AO和XO结构一致，是由两个相同的约150kda亚基组成的同型二聚体。每个亚基被细分为三个不同的结构域：一个20kda的N端结构域与两个含铁的簇结合，一个40kda的结构域包含黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点，以及一个容纳辅因子钼(Mo)原子的C端结构域。钼和FAD一起作为酶催化所必需的成分^[6-8]。AO有明显的种属差异，在人体中有且仅有一种活性的AOX1亚型。大鼠和小鼠的肝内同时存在AOX1和AOX3两种亚型，食蟹猴和豚鼠肝内只有AOX1一种亚型。犬肝中不表达任何AO基因。

2.1 反应特征

AO和XO是含钼、不依赖NADPH的胞质酶，催化含N杂环化合物的氧化和还原^[1]。

亚细胞分布：胞浆；

器官分布：含量最高的组织是肝脏，其次是肺、肾脏和小肠，脑中几乎没有；

辅助因子：不需要辅助因子；

反应式：RH+H₂O---ROH+2e^-+2H⁺ 氧原子的来源是水而不是氧气；

AO典型底物：卡巴唑仑（Carbazeran），酞嗪（Phthalazine）；

AO典型抑制剂: 雷洛昔芬（Raloxifene），雌二醇（Estradiol）；

XO典型底物：喋呤（Pterin），黄嘌呤（Xanthine）；

XO典型抑制剂：叶酸（Folic acid），别嘌呤醇（Allopurinol），别嘌呤二醇（Alloxanthine）

反应式举例如下：

图3. AO及XO反应式

2.2 评估策略

我们在评估AO和XO的体系中，以肝胞浆作为孵育基质，分别选择carbazeran/pterin和raloxifene/allopurinol作为底物和抑制剂，经过一系列时间的孵育，比较在含与不含抑制剂的条件下化合物的代谢区别从而判断化合物是否是AO或XO的底物。

2.3 体系验证结果

评估在含与不含AO抑制剂raloxifene条件下，carbazeran在人肝胞浆中代谢数据和文献数据对比，数据和文献一致。

评估在含和不含XO抑制剂allopurinol条件下，pterin在人肝胞浆中代谢数据和文献一致。

表3. AO及XO验证数据

通过以上验证实验，可以在肝胞浆中添加AO或者XO的抑制剂，评估化合物是否被AO或者XO进行代谢的。

三、醛酮还原酶（AKR）

AKR是结构上相关的一组蛋白，它们有共同起源。这些蛋白形成(β/α)₈或三磷酸异构酶-基序，这是一种紧凑、适应性强的结构，这种结构变异可以满足羰基底物化学结构上的多样性结合的需求。AKR的活性位点位于结构的C末端，在没有典型的Rossman折叠的情况下，可与吡啶核苷酸进行高亲和力的相互作用。具体晶体结构见下图，条带图是与核苷酸辅因子和底物类似物结合到活性位点的蛋白质的侧视图。活性位点环标记为-A、B和C，环B处的球棍结构是NADPH分子，环C处的结构是谷胱甘肽类似物，1,2-二羧基乙基谷胱甘肽，可与酶的底物结合位点结合^[9]。

图4. AKR的晶体结构

3.1 亚型

迄今为止，已在人类中鉴定出13种AKR蛋白，包括AKR1A1、AKR1B1和-B10、AKR1C1、-C2、-C3和-C4、AKR1D1、AKR6A3、-A5、和-A9、AKR7A2和-7A3。其中AKR1C3是研究的热门。在文献^[10]中提到PR-104是氮芥前药PR-104A的一种磷酸酯，已在成人白血病临床试验中显示出疗效。PR-104A最初被设计为针对缺氧细胞，可被AKR1C3激活。另有文献^[11-12]提到，OBI-3424是一种高度选择性的前药，可被AKR1C3转化为一种有效的DNA烷基化剂。OBI-3424获得美国FDA颁发的孤儿药资格，用于治疗肝细胞癌，它是一种潜在的急性淋巴细胞白血病的新治疗方法。其作用机制如下图^[11]：

图5. OBI-3424被AKR1C3激活为活性药物

3.2 催化反应特征

AKR是一类依赖辅因子的超家族，催化酮类和醛类还原到对应的醇^[1]。

亚细胞位置：胞浆；

器官分布：肝脏、乳腺和脑；

辅助因子：NAD+和NADP+；

典型底物：甲萘醌（Menadione），甘油醛（Glyceraldehyde），硝基苯甲醛（P-nitrobenzaldehyde）和黄体酮（Progesterone）。一些内源性底物有类固醇（Steroids）, 前列腺素（Prostaglandins） 和胆酸类（Bile acids）。

图6. AKR典型底物之一黄体酮结构

3.3 评估策略

我们在评估AKR的体系中，选择肝胞浆作为孵育基质，选择Progesterone作为阳性对照，通过一系列不同时间点的孵育，验证其在5个主要种属中的代谢情况。

3.4 体系验证结果

Progesterone在不同种属的肝胞浆中有很好的代谢趋势，其在人种属的代谢和文献中该化合物在其human亚型AKR1C3和AKR1C1重组酶中的代谢趋势一致。

图7. 各种属中底物被AKR代谢的半衰期

通过以上验证实验，Progesterone在三次实验中有很好的平行性。对于未知化合物，如果有明显的醛或者酮结构，可以利用该体系初步验证是否由AKR进行代谢，同时我们也将继续探索AKR的特异性抑制剂。

四、黄素单加氧酶（FMO）

FMO是一种存在于肝微粒体和肝细胞中主要的Non-P450氧化酶，在机体参与治疗药物或外源物生物转化中作用仅次于P450酶。FMO属于B类黄素蛋白单加氧酶家族，即依赖NADPH和分子氧、且不含亚铁血红素的单加氧酶。FMO蛋白的分子质量约为60kDa，其532-558个氨基酸残基中包含高度保守的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和NADPH结合结构域^[13-16]。

4.1 亚型

FMO的表达水平存在明显的组织、年龄、性别以及种属差异^[1,15]。

组织特异性：以人为例，成人肝脏中以FMO3和FMO5为主，肾和肠中以FMO1为主，肺中以FMO2为主；

发育因素：人胎肝中以FMO1为主，出生后FMO1的表达被抑制，逐渐以FMO3为主；

性别差异：雄性小鼠肝脏以FMO1为主，而雌性小鼠肝脏以FMO3为主，而人FMO无明显性别差异；

种属差异：与成人肝脏中FMO1低表达不同，大鼠、小鼠、犬肝中FMO1是主要表达形式，但雌性小鼠主要表达FMO3。

图8. 成人组织中FMO不同亚型分布

4.2 催化反应特征^[1]

亚细胞结构：内质网膜；

器官分布：肝脏、肾脏、肠、肺、大脑、皮肤、胰腺和分泌组织；

辅因子：NADPH；

底物：丙咪嗪（Imipramine）（FMO1）、环苯扎林（Cyclobenzaprine）（FMO3）、卞达明（Benzydamine）（FMO1和FMO3）；

抑制剂：甲巯咪唑（Methimazole）、硫脲（Thiourea）。

4.3 评估策略

采用肝微粒体作为反应基质，通过加与不加FMO抑制剂Methimazole，采用Benzydamine作为阳性对照，比较化合物在两种条件下的代谢差异。

采用FMO主要重组酶（FMO1, FMO3, FMO5）评估代谢化合物的FMO酶的亚型。

4.4 体系验证结果

肝微粒体中含和不含抑制剂条件下，Benzydamine的代谢有明显差异。

图9. Benzydamine在±抑制剂条件下代谢有明显差异 

以FMO3重组酶代谢为例，Benzydamine有明显的代谢趋势：

图10. FMO3重组酶对 Benzydamine代谢有主要贡献

通过以上验证数据，可以采用肝微粒体在含和不含抑制剂Methimazole体系初步判断未知化合物是否由FMO进行代谢，如想进一步判断是哪种亚型进行代谢的，可采用重组酶方式进行实验验证。

五、单胺氧化酶（MAO）

5.1 简介、亚型和反应特征^[1,17-19]

MAO属于黄素蛋白酶，该类酶存在于体内大多数组织细胞的线粒体外膜中。主要的反应如下：

RCH₂NH₂ (substrate) + O₂----RCH=NH+H₂O₂

RCH=NH+H₂O----RCH=O+NH₃

亚型：MAO-A和MAO-B，其具有70%的同源性；

底物：5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine）和去甲肾上腺素（norepinephrine）可作为MAO-A的底物；苯乙胺（2-phenylethylamine）和苄基（benzylamine）可作为MAO-B的底物； 

抑制剂：clorgyline（MAO-A），(R)-deprenyl（MAO-B），Pargyline（MAO-A和MAO-B）。

图11. 几个代表性MAO底物及抑制剂的结构式

5.2 评估策略

我们采用人肝线粒体作为反应基质，以5-Hydroxytryptamine作为底物，通过一系列不同时间点孵育，研究5-Hydroxytryptamine的代谢情况。

5.3 体系验证结果

5-Hydroxytryptamine 代谢情况如下图，具有很好的代谢趋势。

图12. 5-Hydroxytryptamine被MAO代谢情况

通过以上数据，可以采用肝线粒体为基质，以5-Hydroxytryptamine作为阳性对照，判断未知化合物是否可能由MAO进行代谢。

结语

本文阐述了以AO/XO/FMO/MAO/AKR为主的Non-P450酶介导的代谢途径和体外研究策略，丰富了体外代谢平台，能够更好的为化学家在新药研发阶段对化合物的结构优化提供参考。2020年FDA指导原则指出：如果某一种特定的代谢酶对药物清除的贡献占药物清除量的25%以上，则认为其对药物清除的贡献是显著的，需要针对该酶开展进一步的研究。药明康德DMPK成功搭建了AO/XO/FMO/MAO/AKR等常见的Non-P450酶的平台，并且已经为客户成功完成该类酶的多个筛选和IND申报项目，从而更准确的评估化合物的代谢途径，更好的助力新药研发和临床前研究。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：刘海娟，王翔凌，陈根富

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟