PROTAC药物在生物样品分析中的挑战

传统的小分子药物或大分子抗体一般都需要通过结合酶或受体的活性位点来发挥治疗作用，但人类细胞中80%的靶点都缺乏这样的位点。而蛋白降解靶向嵌合体即Proteolysis-Targeting Chimera (PROTAC)（在上下文中简称为“PROTAC”）作为一种新兴的小分子新药研发策略，在很大程度上结合了小分子化合物和小分子核酸的优点，可以通过任何角落、缝隙的结合位点来抓住靶蛋白，更容易进入细胞发挥作用。

PROTAC技术作为新药研发的新策略，正在不断地迭代更新，具有非常大的发展空间和治疗前景，也是近年来炙手可热的研究领域。目前大多数研究还聚焦在探讨目标蛋白与泛素连接酶各自配体的“二原复合物”稳定性上，但在2021年10月22日《自然》子刊Nature Chemical Biolog中的一篇论文发表了一种三价PROTAC分子SIM1，包含两个蛋白结合域和一个E3泛素连接酶结合域，能与两个BET家族蛋白BRD4和E3泛素连接酶VHL结合，更好地结合靶标蛋白^[1]。该三价PROTAC分子与二价PROTAC分子MZ1^[2]相比，不但提高了蛋白降解效率，能够更有效地抑制癌细胞凋亡，在动物实验中也表现出良好的药代动力学特征，有着更好的治疗潜力。

图1：三价PROTAC分子作用机理^[1]

目前PROTAC药物透过细胞膜的机制还尚不清楚，需要更多的理论和实践来支撑其在吸收、分布、代谢、排泄以及毒理方面的研究。这类药物虽然有着巨大的潜力和优势，但由于分子结构较为复杂，会造成其成药性不佳，对临床试验，生物分析以及PK/PD研究等方面造成了巨大的挑战。本文主要讨论PROTAC药物在生物分析方面的一些挑战及实践经验。

在生物分析方面，由于PROTAC分子是由靶蛋白配体、连接子Linker和E3连接酶配体三部分组成，导致相对分子质量较大，一般会达到1000左右，由于在质谱中存在多电荷离子，导致信号分散，可能会带来灵敏度的损失。另外，PROTAC分子中的linker结构脆弱，容易断裂，根据我们的实践经验，在使用LC-MS/MS分析过程中，优化质谱参数非常关键，避免发生源内裂解。这类化合物往往还存在多个手性中心，液相色谱峰可能出现裂峰，需要通过调节液相方法来优化峰形，使分析更顺利的进行。其暴露在外的离子还可能会和玻璃或塑料等耗材发生非特异性结合^[3]，需要消除非特异性吸附，保证化合物在操作过程中没有损失。一般来说，这类化合物冻干的粉末是稳定的，但当其存在于生物基质中时，可能会出现一些隐蔽的稳定性问题，要及时发现并采取避免措施，保证数据的准确性。

一、PROTAC生物分析要点

最优的质谱参数

PROTAC药物结构中脆弱的linker结构使得其容易发生源内裂解，通过低电离能量和离子源温度的优化，可以减少源内裂解的发生。另外对于此类分子量较大的化合物，通过寻找多电荷，进一步优化质谱条件，提高灵敏度，目前最低定量限可达1ng/mL。

优化峰形—裂峰

由于PROTAC结构中存在多手性中心，导致其液相色谱峰出现裂峰，可通过优化液相方法（如更换流动相、筛选色谱柱、调节梯度、降低离子源温度等）可得到对称且较好的峰形，峰形改善的同时化合物信号也有很大提升。

图2：化合物A色谱峰优化前后对比

消除非特异性吸附

PROTAC属于较大分子量（~1000 Da）的小分子化合物，暴露在外的离子容易与玻璃或塑料等耗材表面发生非特异性结合，在动物给药后的样品采集时要注意采用合适的容器材料，尽量使用低吸附耗材，而且要在分析方法开发时对化合物进行吸附性考察。如果发现化合物与耗材有非特异性结合，需要添加一定比例的解吸附剂（如曲拉通、吐温20等）来阻断非特异性结合位点，保证在操作过程中化合物不会损失（表 1）。

表1：化合物B分别在空白血浆中添加解吸附剂前后转移三次比较

备注：T1: 化合物B在空白血浆中转移一次；T2: 化合物B在空白血浆中转移两次；T3: 化合物B在空白血浆中转移三次

可控的基质稳定性

在实际工作中发现PROTAC药物存在独特而隐蔽的血浆稳定性问题。一般来说，新鲜基质中的酶活性会高于冻存过的基质，因而对酶敏感的化合物在新鲜的基质或样品中会更加不稳定。但有些PROTAC化合物表现出在新鲜基质中室温放置2小时是稳定的，而在冻存过的基质中很不稳定的反常现象（表2），且暂未发现有抑制剂可以将其有效的稳定。针对这些PROTAC化合物的这一特点，应使用新鲜的空白基质配制线性和质控样品。

表2：化合物C分别在新鲜空白血浆和冻存空白血浆中的室温两小时稳定性比较

同时，为保证待测样品数据的准确性，要避免样品被反复冻存。生物样品采集后直接进行蛋白沉淀处理，获得上清液保存待测，这种情况下，仅需要考虑处理后的样品上清的稳定性情况即可。以化合物C为例，我们在新鲜基质中定量加入标准溶液以模拟真实样品情况，蛋白沉淀处理后的上清液分别在4℃液相进样器和-40℃冰箱中放置24小时，然后与0小时样品同时进行LC-MS/MS检测，发现其上清在4℃进样器以及-40℃冰箱中放置24小时均稳定（表3）。证明生物样品在采集后立即进行蛋白沉淀处理，获得上清液样品保存待测的方法在DMPK项目的分析中是可行的。

表3：化合物C在新鲜血浆基质上清液中的稳定性

生物分析中每个操作步骤环环相扣，我们在样品前处理阶段还使用HP D300e数码滴定设备达到8s快速完成线性和质控样品的制备，一步完成，无需多次化合物溶液转移，减少非特异性吸附。生物样品在采集后立即沉淀，整个样品前处理过程在湿冰条件下进行，确保样品浓度检测的准确性和可信度，为PROTAC药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄实验提供了可靠的数据支撑。

二、PROTAC生物分析流程

针对PROTAC药物不同的特点，结合我们的分析经验，将PROTAC生物分析流程总结为以下几点：

图3：PROTAC药物生物分析流程

图4：PROTAC生物样品分析平台

药明康德药性评价部Non-GLP生物分析团队拥有一体化及全能力生物分析平台，能够提供各类创新分子实体的生物分析服务，贯穿于药物研发临床前各个阶段。其中运用LC-MS/MS平台进行PROTAC生物样品分析已有多年的经验，在与诸多客户合作中，完成了数万个生物样品的分析工作，助力客户PROTAC药物的研发速度。

结语

在PROTAC药物研发过程中，药明康德药性评价部Non-GLP生物分析团队所打造的PROTAC化合物分析策略，帮助客户高效的完成实验，数据准确可靠，助力客户的药物研发进程。我们拥有经验丰富的专业分析团队、先进的分析仪器设备、全流程信息化管理和可靠的质量管理体系，可持续赋能客户，高效、高质量地完成涵盖药物筛选到药品临床试验申报各阶段中生物发现、体内外药代动力学、药效学以及毒理学的生物分析服务。希望能为更多的PROTAC药物研发赋能助力，服务于全球更多的制药公司和研发机构，从而让更多的医药产品成功上市，造福更多的病患。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。  

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作者：党甜甜，胡维民，曹卫群

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟