ABC转运体体外研究模型的应用及策略

转运体（transporter）是一类表达于细胞膜的功能蛋白，参与药物的吸收、分布和排泄过程，其功能缺失或下调会影响机体对药物的处置。此外，转运体介导的药物相互作用（drug-drug interaction，DDI），会导致临床上药物在机体内的处置发生显著变化，可直接或间接地影响药效，严重者甚至会诱发毒性^[1]。美国、欧洲和中国的药品监管部门相继出台指导原则，建议体外评估主要转运体与受试药物之间潜在的相互作用，为体内研究提供参考。本文旨在系统阐述ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运体的体外研究方法，助力新药研发进程。

一、ABC转运体的介绍

根据转运机制的不同，转运体可分为两种类型，分别为ABC型转运体与溶质载体（solute carrier，SLC）型转运体^[2]。ABC型转运体因其在转运底物时需要依赖ATP水解直接产生的能量而得名，其ATP的结合位点位于细胞内（图 1）。

图1. ABC型转运体示意图^[3]

二、ABC转运体体外研究模型

目前，体外评估由ABC转运体引起的DDI模型主要包括膜囊泡模型、极化单层细胞模型以及“三明治”培养肝细胞模型^[4]。

01 膜囊泡模型

囊泡可通过感染昆虫细胞（如Sf9或Sf21），或转染哺乳动物细胞（如HEK293、HeLa、V79或MDCK）进行制备。通过特殊工艺将囊泡外翻后，原本表达在胞内的底物结合位点将被外翻至囊泡外，俗称“inside-out”或“inverted”膜囊泡。

因底物结合位点暴露在囊泡外，在进行DDI研究时，药物无需经过跨膜步骤进入到胞内，而是可以直接与底物结合位点接触，通过测定ATP依赖性的转运即可。基于这一特点，膜囊泡模型可用于底物特异性、辅因子要求和底物亲和力等方面的研究。且因囊泡并不是活细胞，因此在评估具有细胞毒性的化合物时可忽略毒性对结果的影响。值得注意的是，当进行底物评估时，若所测试化合物具有高渗透性或强非特异性吸附等特性，可能会因为背景值较高而造成假阴性的结果。

图2. 膜囊泡模型示意图

02 极化单层细胞模型

极化单层细胞模型是指采用能够自发极化形成完整细胞单层的细胞系进行转运体DDI研究的模型。Caco-2细胞是常用的细胞模型，除此之外，特定转运体高表达的上皮细胞系，如LLC-PK1（Lewis肺癌猪肾细胞1）和MDCK等也可用于相关研究。

Transwell小室用于辅助药物跨细胞膜研究。将细胞接种在Transwell小室上，培养至形成完整的极化细胞单层，通过开展双向渗透性实验（顶端到基底端（apical‑basolateral，A-B）和B-A方向），并在含有或不含特定ABC转运体抑制剂的条件下，进行双向表观渗透系数（apparent permeability coefficient，P_app）以及外排率（efflux ratio，ER）的计算，评价化合物是否为该ABC转运体底物（图3）。此外，通过测量探针底物在B-A方向的净流量或ER值的变化，也可以进行化合物对特定转运体抑制作用的评估。

采用Transwell模型开展双向渗透性实验进行与ABC转运体的相互作用研究，需要注意以下三点：

• 回收率：若所测试化合物非特异性吸附较强，或易滞留在细胞内，则可能会导致回收率不充足（通常低于70.0%）；此外，该模型细胞孵育时间较长（通常大于60分钟），胞内代谢酶等因素需加以考虑。

• 化合物自身的跨膜能力：外排转运体底物结合位点位于胞内，测试化合物需跨膜到达胞内后，与底物结合位点作用，若所测试化合物的被动扩散较差，且较难通过转运体的介导进入胞内，则会影响DDI评估。

• 测试浓度：测试化合物在Transwell模型中的双向转运是被动转运及主动转运双重机制叠加的结果，其被动扩散符合Fick扩散定律，若所测试化合物的浓度过高，可能会导致被动转运的化合物量远高于转运体主动转运的量，掩盖了转运体主动转运的作用。另一方面基于米-曼氏模型（michaelis-menten model），高浓度的测试化合物会使转运体的结合位点饱和，从而得到假阴性的结果。

图3. Transwell小室示意图

需要注意的是，当采用Caco-2细胞进行ABC转运体的底物评估时，由于其膜上表达多种外排转运体，应使用两种或两种以上的特异性抑制剂以确定外排的特异性^[5-7]。此外，当测试化合物同时是两种外排转运体的底物时，Caco-2细胞模型中的一种外排转运体的高外排，可能会影响另一种外排转运体的外排作用，且在添加了一种外排转运体的特异性抑制剂后，也可能会导致另一种外排转运体的外排作用代偿性增大，从而出现假阴性的结果。

03 “三明治”培养肝细胞模型

将新鲜分离或冷冻保存的肝细胞在胶原包被的细胞培养板上培养，并覆盖胶原或基质胶，称为三明治培养法（图4），培养特定时间后（一般需要4-6天），肝细胞极化并重建胆小管网络。

“三明治”培养的肝细胞在含有EGTA适宜的缓冲液中，胆小管网络的紧密连接结构会被破坏，因此可通过比较正常缓冲液（包含胆小管网络，且胆小管网络紧密连接正常）中化合物的蓄积量与含有EGTA的缓冲液（代表细胞积累）中化合物的蓄积量，来进行化合物与胆小管外排转运体相互作用的研究，在此条件下，通过添加特定外排转运体的抑制剂，也可用于进行测试化合物是否为特定胆小管外排转运体底物的评估。

图4. “三明治”培养肝细胞模型示意图

“三明治”培养肝细胞模型，对肝细胞的活力以及转运体表达要求较高，且肝内代谢酶以及转运体的活性受培养条件影响较大。此外，在评估测试化合物与胆小管外排转运体相互作用的同时，肝内的代谢酶也会持续不断的发挥作用。因该模型培养周期较长、对肝细胞的质量要求较高且数据解读较为复杂，因此一般不用于早期的高通量筛选。

上述3种体外模型各有优势与局限性（表1），可结合不同模型的适用场景，选择合适的模型开展相关研究。

表1. 三种体外ABC转运体模型的优势与局限性

三、ABC转运体研究的案例

研究模型的选择应结合药物自身的理化性质及实验目的，选择合适的体外模型。以下将通过实际案例，对采用膜囊泡模型和极化单层细胞模型在研究药物与ABC转运体相互作用的差异进行阐述，并结合分子类型，提供初步的选择策略，助力新药研发。

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跨膜能力差化合物ABC转运体的抑制与底物评估

ABC转运体的抑制评估

已知Compound A跨膜能力较差，分别在Caco-2细胞模型以及MDR1膜囊泡模型中开展对P-gp抑制作用的评估，结果如图5所示。

图5. Compound A在Caco-2细胞模型（a）以及MDR1囊泡模型（b）开展对P-gp抑制作用的评估

因Compound A的跨膜能力较差，因此Compound A能够进入到Caco-2细胞内的游离药物浓度可能较低，无法充分发挥其对P-gp的抑制作用；而在MDR1膜囊泡模型中，Compound A可以与P-gp的结合位点直接接触发挥其抑制作用，并不需要透膜的过程。

药物在体内发挥其对ABC转运体的抑制作用也需要进入到胞内，但由于体内、体外环境差异，药物在体内进入到细胞内的程度会受到多重因素的影响，如体内组织细胞膜表面受体或摄取转运体的介导等。因在体外的极化单层细胞模型中，较难评估出跨膜能力差的化合物对ABC转运体的抑制作用，因此数据参考意义不大。

尽管采用膜囊泡模型得到的是一个真实的在底物结合位点附近游离药物浓度所引起的抑制作用，可能会高估其对ABC转运体的抑制能力，但鉴于在体外我们应尽可能获得更小的半数抑制浓度，以避免潜在的临床DDI。因此在膜囊泡模型中得出的抑制结果，对于在体内是否有可能会引起转运体介导的DDI更具有指导意义。当然，在数据的使用时，也应结合所采用的模型进行综合解读。因此，对于跨膜能力较差的化合物而言，建议采用膜囊泡模型进行其对ABC转运体抑制作用的评估。

ABC转运体的底物评估

分别在Caco-2细胞模型以及BCRP膜囊泡模型中进行Compound B是否为BCRP底物的评估，结果如表2所示。两种模型得出了相反的结论。

表2. Compound B在Caco-2细胞模型以及BCRP膜囊泡模型开展BCRP底物的评估

由于体内、体外环境差异，跨膜能力差的化合物在体外极化单层细胞模型中较难跨膜进入到胞内，并不能代表其在体内的环境也是如此，而通过膜囊泡模型对跨膜能力差的化合物进行是否为ABC转运体底物的分析，会对后续是否有可能引起转运体所介导的临床DDI更具有指导意义。因此，对于跨膜能力较差的化合物进行ABC转运体的底物评估时，膜囊泡模型更具优势。

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高渗透性化合物ABC转运体的底物评估

分别采用Caco-2细胞模型以及BCRP膜囊泡模型进行Compound C是否为BCRP底物的评估。结果如表3所示。两种模型也得到了相反的结果。

表3. Compound C在Caco-2细胞模型以及BCRP膜囊泡模型开展BCRP底物的评估

因Compound C具有高渗透性，因此在膜囊泡模型中，被动扩散跨膜进入膜囊泡内高背景的Compound C，掩盖了BCRP介导的摄取转运，从而导致在囊泡模型中得到了假阴性的结果。因此对于高渗透性的化合物而言，采用膜囊泡模型进行ABC转运体底物的评估时，可能会得到假阴性的结果，对这类化合物，极化单层细胞模型更有优势。

药明康德DMPK体外ABC转运体研究服务

药明康德DMPK已有多种成熟稳定的体外转运体研究模型。Caco-2细胞模型可用于P-gp和BCRP相关研究、MDR1‑MDCK转染细胞模型可用于P-gp相关研究，以及P‑gp、BCRP、BSEP和MRP1/2/3/4的囊泡模型可用于相关转运体研究。我们也可以结合客户项目需要，定制化开发“三明治”培养肝细胞模型。根据测试化合物的分子特性，我们还能帮助客户选择合适的模型开展P-gp和BCRP相关研究（表4），以提高实验精准度，为保障用药安全提供坚实的科学基础。

表4. 体外P-gp和BCRP转运体研究模型的选择

备注：✓推荐开展；×不推荐开展。

a若所评价的常规小分子（或XDC payload）被动扩散较差，且较难通过转运体的介导进入胞内，则推荐采用膜囊泡模型进行评估。

b囊泡模型不适用于高渗透以及高非特异性吸附药物的底物评估，若所评价的PROTAC或多肽具有高渗透性，则推荐采用MDR1-MDCK和/或Caco-2细胞模型。

药明康德DMPK团队在转运体介导的药物相互作用研究领域积累了丰富的经验。目前已成功建立了7种ABC转运体（P-gp、BCRP、BSEP、MRP1/2/3/4）以及12种SLC转运体（OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、OAT1、OAT3、OCT1、OCT2、MATE1、MATE2-K、PEPT1、PEPT2和NTCP）的研究模型，覆盖了各监管机构推荐的所有与药物可能会发生相互作用的转运体类型，不仅可以进行底物与抑制的评价，也可以对转运体底物进行K_m和V_max的测定。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：时恭芳，刘青，毕亚娟，熊涛，陈根富

编辑：钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹