寡核苷酸药物的血浆蛋白结合研究——意义、方法和策略

寡核苷酸药物是近几年来药物研发项目中非常热门的一类新型治疗药物。这些短的DNA或RNA分子旨在调节基因表达，为各种疾病提供靶向治疗。在寡核苷酸药物的临床前开发中，由于各国药监机构尚未针对这类药物的DMPK研究出台正式的研究指南，研究者是否需要像小分子化学药物一样开展相关的研究内容，并将其纳入新药申报资料中以及如何开展相应的研究是我们需要探讨的问题。本文将针对血浆蛋白结合研究，分别对反义寡核苷酸（anti-sense oligonucleotide，ASO）和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）两种药物的蛋白结合研究意义、研究方法和策略进行简要介绍。

一、蛋白结合对小分子药物性能的影响

血浆蛋白结合率（plasma protein binding, PPB）是指药物与血液或血浆内蛋白的结合程度。在药理学中，药物以两种形式存在：未结合型及结合型。未结合的药物分子可穿过细胞膜扩散，到达其作用部位并被消除。相比之下，与血浆蛋白结合的药物大部分保留在血管腔内，提供了可保留的药物储库，随着游离药物浓度下降，结合的药物被释放到循环中（图1）。

结合与未结合药物之间的平衡在小分子药物研发中的意义十分重大，这与被普遍认可的“游离药物假说”密切相关。该假说由两部分组成：(i) 作用部位的游离药物浓度是驱动药理作用的主要因素。(ii) 在稳态状况下，对于非摄取或外排转运蛋白底物的药物，任何生物膜两侧的游离药物浓度是相同的^[1,2] 。其中第二部分对于理解小分子药物，特别是调节胞内靶点的药物的PK/PD尤为重要。因此，PPB是小分子药物研发中常规测定的一种关键参数，用于建立PK/PD关系、种属间的参数换算，以及计算药物的治疗指数。

图1. 药物在血液和多种器官之间的平衡^[3]

二、蛋白结合对ASO性能的影响

ASO与蛋白的结合也可以影响其许多方面的性能，包括组织分布和组织递送、细胞摄取、细胞内转运、药效和毒性^[4]。ASO的血浆蛋白结合会极大地影响其系统清除，尤其是肾脏清除^[5]，而与细胞表面蛋白的结合可以调节ASO的细胞摄取能力。另一方面，与组织细胞内的蛋白结合也对ASO的组织半衰期有较大影响。

ASO的亲水性和序列特征可以影响它的蛋白结合程度及结合速度。低蛋白结合的ASO，其细胞摄取能力也比较低，且肾清除率较高。例如，吗啉环（PMO）修饰的ASO，通过引入吗啉环、排除磷酸二酯键增加了亲水性。它们的血浆蛋白结合率通常为40%或更低，明显低于硫代磷酸酯（PS）修饰的ASO。由于亲水性增加，他们主要的排泄途径是通过尿和粪排泄。相反，高蛋白结合的ASO，如PS-ASO，研究人员通过增加亲脂性和对核酸酶的耐受性，提高裸核酸的成药性。它们往往具有较高但非特异性的细胞摄取，在组织中的保留时间长，并因此可能产生一些安全问题。

人们发现与ASO结合的血浆蛋白种类已有三十年了，但目前人们仍然不能完全理解ASO-蛋白相互作用的机制及对细胞摄取和生物分布的影响^[6]。在一项研究中，一个与血浆蛋白具有高亲和力、特异性结合的ASO，其蛋白结合直接影响了在α 2巨球蛋白基因敲除小鼠中的药效^[7]。从循环中去除这个蛋白后导致ASO的活性显著增加，表明与蛋白结合可以调节ASO分流至非生产性途径，同时这可能与ASO在周围组织的分布过程发生改变有关。但目前并不提倡通过结构修饰来优化ASO蛋白结合特性，因此人们也在尝试多种其他技术，如偶联技术来增强细胞摄取或提高对特定组织的靶向选择性。与一些亲脂性强的基团偶联后的ASO^[8,9]有更强的血浆蛋白结合能力，并导致更强的细胞摄取。

ASO的组织分布特征一般是在肾脏，肝脏，脾脏，淋巴结、脂肪细胞和骨髓中的浓度较高^[10,11]。它们的组织分布不仅取决于血流/灌注，同时也受蛋白结合特性的影响^[12]。ASO的化学修饰可导致其分布模式的显著差异，部分原因也是由于它们的蛋白结合能力发生了改变^[13-15]。总之，与血浆和细胞蛋白的结合对于ASO在体内的作用持久性、组织分布和细胞摄取至关重要。

三、蛋白结合对GalNAc-siRNA性能的影响

对于GalNAc-siRNA，与血浆蛋白结合的药理作用及对PK和药效的影响在目前尚未有明确报道。在一项研究中，研究人员发现很大比例的GalNAc-siRNA和血清蛋白发生了结合，但血清蛋白结合对GalNAc-siRNA在原代人肝细胞中的摄取和活性没有产生影响^[16]。血浆中游离siRNA的浓度与它们的药效之间未发现直接关联，且与血浆蛋白结合似乎并没有保护inclisiran在肾小球的滤过率。但随着GalNAc-siRNA化学技术的不断发展，未来的GalNAc-siRNA不一定会表现出同样情况，相关研究领域的专家主张继续对血浆PPB和血液PK之间的关系进行监测^[17]，因为GalNAc-siRNA结合蛋白或结合亲和力的变化会导致siRNA分布和暴露量发生改变。此外，对血液分布过程的深入理解，包括血浆结合蛋白的种类和结合程度，有利于确立肝外递送的研究策略。关于siRNA PPB是否为新药申报所必须包含的部分，建议当 siRNA 包含新的化学修饰、连接体、配体、赋形剂，或尚未在临床批准的药物中进行检测的制剂时，或者有理由认为血浆游离药物浓度可以影响PK、PD和/或安全性，siRNA的PPB报告应纳入申报资料中（图2）。

图2. 新药申报的角度的siRNA PPB研究决策树^[18]

四、寡核苷酸药物的蛋白结合测定方法

ASO和siRNA的理化性质与小分子药物有明显差异，尤其在分子量、形状和表面电荷方面，因此，直接应用小分子PPB的方法测定寡核苷酸会出现一些问题。测定 PPB 时需要解决的主要问题是非特异性结合（NSB）。寡核苷酸可以非特异性地与实验室耗材（如微孔板和吸头）结合，严重的NSB会导致结果不准确。可以采用不同的方案，如低吸附耗材和预处理步骤，以尽量减少 NSB，详细的降低NSB的方案可参考我们已发布的文章：非特异性吸附的产生和解决策略解析。目前已报道的蛋白结合测定方法中，ASO有超滤法^[19,20]和超速离心法^[21]，siRNA主要有超滤法^[22]和电泳迁移法^[23](EMSA)。这些方法都有一定的局限性，如成本、通量和回收率的限制。以下我们对其中两种方法的优势和局限性进行介绍。

EMSA法

由于简单、快速和低成本，EMSA成为研究蛋白质与DNA或RNA之间相互作用最常用的方法之一。典型的EMSA实验通常使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 或琼脂糖凝胶电泳，从结合复合物中分离游离的核酸。聚丙烯酰胺凝胶历来被使用的更多，是因为其对相对较小的核酸具有更高的分辨率^[24]。琼脂糖凝胶的EMSA在过去通常局限于分离较大的核酸，为了提高寡核苷酸的分辨率，研究人员采用了多种方法，包括提高琼脂糖百分比、改变运行缓冲液、提高电压等^[25]。改进后的方法可以用更短的运行时间（<10 min）实现更快速的分离，减少了核酸在凝胶中的扩散，获得更清晰的条带，同时降低了蛋白结合复合物解离的机会，这是非平衡核酸结合实验中的一个重要关注点。EMSA法需要关注的地方：在凝胶上样时样品需要用专门的上样溶液对血浆进行稀释，蛋白结合率的准确度是否会受到稀释液的组成成分的影响，以及稀释效应的影响。此外，核酸的染色在较宽的浓度范围内并不呈线性关系^[26]。如图3为我们实验室中几个寡核苷酸化合物的浓度与琼脂糖凝胶电泳（E-Gel™ Power Snap电泳仪）上样品条带灰度值的最佳拟合线，不同的化合物呈现出半对数线性关系（A），或对数线性关系（B）。

图3. 几个寡核苷酸化合物的浓度和琼脂糖凝胶电泳（E-Gel™ Power Snap电泳仪）灰度值的最佳拟合线，不同的化合物呈现出半对数线性关系（A），或对数线性关系（B）。

超滤法

超滤法的一个优势是可以在纯血浆中进行实验，不必采用稀释血浆，同时保证实验过程中体系的pH接近于生理pH值。将超滤管用去污剂进行预处理后，可实现较低的非特异性结合。超滤法需要关注的地方：如果siRNA分子大小接近50 kD超滤管过滤器的截留分子量上限，较长的siRNA，或配体体积较大的siRNA可能会出现回收率偏低的现象。另外，可能出现蛋白渗漏现象，任何流体动力学半径小于过滤膜孔径的物种都可以通过滤膜，因此，在理论上，如果寡核苷酸与小分子量的蛋白发生结合且通过了滤膜，则PPB与真实值会出现偏差。

表1展示的是我们实验室用超速离心法和超滤法测定的几个ASO化合物在PBST（添加了Tween-20的磷酸钠缓冲液）中的游离率，以评估超速离心法的离心沉降率和超滤法的膜透过率。这几个化合物在超滤法中的游离率和回收率较高，表明非特异性吸附可以被忽略。超速离心法得到的游离率偏低，表明游离的分子在缓冲液中存在一定的沉降。表2为我们实验室用超率法测定的血浆蛋白渗漏率，超滤液中的蛋白含量通过BCA法进行测定。超滤法的实验条件需经过优化，确保蛋白渗漏率最低。

表1. 超速离心法和超滤法比较几个ASO化合物在PBST中的游离率

表2. 超率法测定血浆蛋白渗漏率

结语

在过去的几年中，研究者们在理解寡核苷酸-蛋白相互作用的性质和重要性方面取得了重大进展，特别是在PS修饰的ASO领域，包括与PS修饰的ASO 结合的蛋白种类、蛋白相互作用对ASO性能的影响以及PS-ASO结构修饰和蛋白相互作用的构效关系。对这些相互作用的深入了解有助于设计更加安全有效的ASO药物。与此同时也产生了更多亟待解决的问题，如能否开发增强亚细胞分布的药物化学解决方案？什么类型的配体可以促进靶向递送到组织，如骨骼肌？相信人们未来的研究可以回答这些问题。此外，对于siRNA，尽管目前已报道的相关研究仍然较少，我们期待未来的研究可以帮助我们更好的揭示蛋白结合(包含血浆、组织等) 在解读PK-PD关系中的作用。

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作者：王洁，李梦瀛，王翔凌，陈根富

编辑：钱卉娟，袁萌

设计：倪德伟，张莹莹