无菌动物——肠道微生物研究新工具

药物的安全性和有效性是临床治疗中重要的关注点，研究表明，人体微生物与药物的治疗效果及不良反应具有显著的相关性^[1]。随着人类基因组计划的完成，科学家意识到解密人类基因组并不能完全掌握人类疾病和健康之间的关系。2007年底正式启动实施“人类微生物组计划”（Human Microbiome Project，HMP），不仅促进了药物微生物组学的产生与发展，而且使药物微生物组学成为当前生命科学研究领域的热点之一。药物微生物组学主要研究微生物差异是如何影响药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄和毒性^[2]。

肠道菌群在维持健康方面起着至关重要的作用。越来越多的研究表明，肠道菌群的变化和紊乱可能与各种疾病的发生有着密切关系。近年来，肠道微生物已成为各领域备受瞩目的研究焦点之一。无菌动物模型是研究宿主与微生物在健康和疾病相关性中最重要的实验模型之一^[3]。本文主要介绍无菌动物模型及其在肠道微生物研究中的重要性，以期加速肠道微生物相关研究的发展。

一、一个有趣的研究

2013年Vanessa K Ridaura等人在Science上发表了一个很有趣的研究成果，在相同饮食的条件下，肥胖会受到肠道微生物的影响。作者挑选了四对成年双胞胎，双胞胎中一人是瘦的，一人是胖的。将双胞胎粪便中的微生物群移植到无菌小鼠（Germ-free mice）体内，这些喂饲了低脂高纤饲料的无菌小鼠，体形也随之发生了变化。实验结果显示移植了胖人微生物的无菌小鼠，体重显著增加，变成了一只胖鼠，这个现象说明肥胖可以通过肠道微生物从人“传染”给小鼠。接着，研究人员将移植了双胞胎微生物的无菌小鼠进行合笼饲养，发现了一个很有趣的结果，如图1B所示，移植了瘦人微生物的小鼠能抑制移植了胖人微生物小鼠的的增重现象，使移植了胖人微生物的小鼠变瘦了。啮齿类动物有食粪的习性，在合笼饲养的过程中，存在于他们体内的微生物会互相影响。越来越多的研究表明，肠道微生物与肥胖之间有着直接的因果关系。这个研究也证明了，肠道微生物是影响体重变化的重要因素之一。

图1. 无菌动物移植双胞胎后合笼饲养10天脂肪量的变化。（Ln）无菌小鼠接受来自双胞胎对瘦人的微生物；（Ob）无菌小鼠接受来自双胞胎对胖人的微生物^[4]

二、肠道微生物和无菌动物的介绍

2.1 肠道微生物

成年人的肠道中存在着超过100万亿的微生物^[5]。越来越多的证据表明，肠道微生物群在促进健康方面发挥着重要作用。肠道微生物是维持体内平衡的关键因素之一，很多科学家将肠道微生物称为人体的另一个“器官”，甚至称为“另一个你”。其功能几乎影响着人体的每个器官，如大脑发育和行为、肝功能、心血管疾病等^[6]。

2.2 无菌动物的发展及分类

无菌动物的发展史：

1963年，生物学家Julian Huxley在一次关于人类未来的研讨会上提出“无菌的世界是荒谬的，不可能存在的”的观点，引发了很大的争议。在1885年左右，确立了在没有微生物的存在的情况下，动物也是可以生存的。无菌动物的发展至今，已有一百多年的历史。

无菌动物分类：

实验动物按照微生物的控制程度，可分为表1中的四个等级^[7]。其中，无菌动物（GF动物）是指通过现有检测技术在体表及体内无法检出任何微生物的实验动物。GF动物在形态学方面，肝脏，心脏，脾脏较无特定病原体动物（SPF动物）轻。在代谢生理方面，GF动物因为长期缺乏外来抗原刺激，整个免疫系统处于休眠状态，免疫系统应答较弱。GF动物因为盲肠巨大也导致了生殖能力低，但寿命较SPF动物长1/3，代谢周期也较长^[8]。

表1. 实验动物微生物控制等级分类

2.3 无菌动物的建立

在没有无菌动物之前，科学家尝试用抗生素使实验动物达到暂时无菌的状态，这些动物被定义为伪无菌动物。然而，因为没有统一的实验方案，抗生素仅能抑制10%-25%的肠道微生物^[9]。另外，抗生素存在潜在脱靶效应，微生物消除效果不确定性较多，实验重复性不高。而无菌动物的特点就是需要整个过程处于无菌状态，可以通过无菌胚胎移植或无菌宫剖的方法获得。图2是无菌宫剖产生无菌啮齿动物的示意图。

图2. 无菌子宫切除产生无菌啮齿动物的示意图^[10]

获得无菌动物后，在饲养过程中还需保证完全无菌的环境。使用聚氨酯材料制备的弹性薄膜隔离器，有助于防止意外刺穿或撕裂造成的包内污染；使用空气过滤器以保证包内无菌的环境；进入包内的物品均需要高温灭菌后方可进行传递。并按照图3的流程进行无菌包的搭建及消毒，以此保证无菌包及后期实验的环境无菌。在此期间，每周需要送检一次环境样本，根据16SrDNA和培养法两种检测方法（图4）显示结果皆为阴性。药明康德DMPK通过近一年的测试，可以保证饲养环境的零污染。

图3. 无菌隔离包检测流程图

图4. 无菌隔离包检测流程图

通过系列方法开发和实践，药明康德DMPK具备对无菌动物进行口服、腹腔注射、皮下注射和肌肉注射四种给药能力，选用颌下采血的方式进行采血操作，并且可以采集常规品系小鼠（CD-1，BALB/c，C57BL/6J等）各种组织和器官。

三、无菌动物对药物代谢的影响

肠道微生物通过肠肝轴，有直接和间接两种不同的机制影响药物代谢。直接机制是微生物对药物的代谢，包括水解或还原反应等。间接机制是微生物代谢物影响宿主受体和信号通路。例如肠道微生物将初级胆汁酸转换成可被肝脏重吸收的次级胆汁酸，激活PXR受体，增加CYP3A的表达^[11]。据文献报道，肠道微生物的缺失可直接影响代谢酶和转运体mRNA的表达，尤其是CYP3A在无菌动物中有显著的下降（图5）。CYP3A参与50%的上市药物的代谢。

在内部验证实验中，使用GF小鼠和SPF小鼠进行对比实验,采集肝脏匀浆后，检测肝脏中CYP3A的mRNA和蛋白的表达以及相关酶的活度。实验结果表明，CYP3A在GF动物体内的表达显著下降。说明肠道微生物的缺失对CYP3A表达有很大的影响。

图5. 肠道微生物的缺失对代谢酶和转运体的影响

四、无菌动物的应用

01 微生物定植。若在体外实验中，发现某种微生物对药物代谢有影响，可以定植该微生物到无菌动物体内，并通过体内药代动力学（PK）实验，量化体内微生物对药物代谢的作用。例如悉生动物模型和CON-D动物模型。

02 辅助开发特异性前药。例如伊立替康，是治疗溃疡性结肠炎的药物，经过微生物代谢后在结肠起治疗作用。

03 无菌动物与转基因动物相结合，研究基因和微生物的相互关系。例如将SPF动物无菌化，可以比较肠道微生物有无对靶基因表达的影响。也可以将转基因SPF动物与GF动物进行对比，可以探究肠道微生物对药物代谢酶或转运体机理的研究。例如图6，代谢酶CYP3A会受到PXR基因的调控，有研究人员猜测CYP3A也会受到肠道微生物的调控。研究人员将敲除PXR基因的动物与GF动物做比较，发现两者的体内药代动力学（PK）实验结果是保持一致的，说明该通路也受肠道微生物的控制。

图6. 肠道产生的不同微生物代谢物^[16]

结语

肠道微生物与人类健康密切相关，但目前对于肠道微生物的研究仍只是冰山一角。对于肠道微生物的功能以及与疾病的关系需要更进一步的研究。将无菌动物作为药物和靶基因的筛选工具，为药物安全性评估及解析疾病发展过程提供更多可能。药明康德DMPK拥有先进的无菌动物饲养设备，领先的实验操作技术和能力，可以承载肠道微生物相关研究的体内药代动力学实验服务，助力新药研发的进程。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。

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作者：林丹清，焦桴荣，董轩，冯全利，汤城

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟