基于高分辨质谱技术的完整蛋白定量定性一体化生物分析

完整蛋白质谱分析（Intact protein mass spectrometry）是指借助超高分辨质谱，跳过酶解或者碎片化，直接在完整层面，对蛋白类药物进行表征的一种分析技术。目前这一技术比较成熟的工业应用是评估批次发布蛋白类药物的纯度与异质性，即质量控制（Quality control）环节。然而，近年来，随着免疫捕获技术与高分辨质谱平台的高速发展，完整蛋白质谱分析技术正越来越多被用于大分子药物的体外体内生物分析当中。相较于常规分析手段，完整蛋白质谱分析技术对于在生物体内成分复杂的一些大分子药物具备准确定量能力的同时，还可以提供全面的结构信息^[1]。本文将结合药明康德DMPK部门的一些经典案例，讨论完整蛋白质谱分析技术在临床前生物分析中的应用。

以单抗药物的生物分析为例，经典的完整蛋白生物分析流程如图1所示。首先需要借助LBA的方法，对生物基质中的目标抗体进行亲和免疫捕获，之后将纯化的样品进行LC-HRMS分析获得原始数据，最后对所得的数据进行定量或者定性处理。

图1. 以单抗类药物为例的经典完整蛋白分析流程

使用抗人抗体（anti-human IgG）捕获基质中的目标抗体，清洗后加酸洗脱，洗脱产物使用LC-HRMS进行分析，所得质谱谱图可以直接进行定量分析或者进行去卷积获得目标蛋白的质量数分布。

一、基本技术与方法

1.1 免疫亲和捕获

对于大分子蛋白的生物分析，利用亲和免疫捕获，实现待测大分子的纯化与富集往往是第一步。亲和免疫捕获技术有两个关键组成部分，捕获试剂与固定相。捕获试剂顾名思义，即从生物基质中对目标蛋白进行亲和抓取的关键试剂，往往是与目标蛋白有特异性结合能力的通用型捕获抗体（Generic antibody），抗原蛋白（Specific antigen）或抗独特型抗体(Anti-idoitype antibody)。固定相则是用于供捕获试剂“粘合”的表面（通常是利用固定相表面的链霉亲和素(Streptavidin)与生物素（Biotin）标记的捕获试剂的高亲和特异性结合），根据其形式，除了在ligand binding assay（LBA） 常用的免疫捕获板以外，主要有磁珠(Magnetic beads)，捕获枪头(Affinity tips)与亲和膜/树脂（Affinity membrane）固相板3种，其各自的特点如表1中所示。药明康德DMPK借助IMCSTips与Hamilton自动化装置，实现了亲和免疫捕的完全自动化，大大提升了大分子生物样品的前处理重现性与稳定性。

表1. 常见亲和固定相形式的对比

1.2  前端分离技术

1.2.1 反相色谱（RPLC, reversed phase liquid chromatography）

反相色谱是目前完整蛋白分析领域最广泛使用的前端分离技术。相较与在小分子与多肽领域获得的巨大成功，反相色谱在完整蛋白的分离应用上仍存在不少问题，其中最突出的就是峰型（峰展宽与拖尾）问题，当然，峰型问题与蛋白本身的复杂结构与异质性密切相关。此外，有些完整蛋白，因其本身的性质，在液相体系各个部分的非特异性吸附，残留等问题也往往需要花费精力去针对性解决，药明康德DMPK团队拥有丰富的完整蛋白分析经验，可针对各种潜在的问题，有的放矢：

• 筛选合适的反相色谱柱，用于完整蛋白分析，以获取更好的峰型；

• 针对性优化流动相与梯度，以获得最佳的峰型与检测下限；

• 对于非特异性吸附严重的蛋白，在免疫捕获后的洗脱剂中添加适量BSA蛋白，抑制目标蛋白在液相色谱体系中的吸附；

• 针对部分糖基化修饰过于复杂的蛋白，开发合适的去除糖基化修饰的方法，简化样品结构从而改善峰型。

1.2.2 其他前端分离技术

RPLC以外，体积排阻（SEC, size-exclusion chromatography）和毛细管电泳（CE, Capillary electrophoresis）技术也被证明可以用于完整蛋白分离，且可与质谱技术联用。

经典反相色谱中，流动相多为低pH的酸性溶液，这意味着大分子在进入质谱分析前，已经处于变性（Denature）条件下，而SEC-MS和CE-MS则可以借助仿生理条件偏中性的洗脱相，让蛋白保持天然状态（Native）下的构象，进入质谱。这二者都因其与RPLC截然不同的分离原理，在完整蛋白质谱分析领域拥有独特的应用，比如SEC的native MS表征， CE-MS的毛细管等电聚焦用于抗体类药物的电荷异质性分析等^[2]。近年来，随着相关接口技术和质谱技术的不断发展， SEC-MS和CE-MS均已被用于完整抗体类药物的体内PK研究当中^[3][4]，与传统RPLC相比，这两种方法的主要缺点在于较差的灵敏度，这往往需要增加上样量或者提高进样时样品的浓度（可以通过降低亲和免疫捕获流程中的洗脱时的洗脱体积实现）来克服，但这对于低剂量体内样品往往较难实施，从而限制了这两项技术在大分子蛋白PK分析领域的应用。

1.3  离子化技术

电喷雾电离（ESI, Electrospray ionization）基质辅助激光解吸/电离（MALDI, matrix-assisted laser desorption/ionization）等软电离离子化技术的发展，也是完整蛋白质谱分析得以实现突破的重要基础之一。其中电喷雾电离技术更是成功地让液相色谱可以在线与质谱串联，在这种情况下，蛋白质得以保持在溶液状态进入质谱检测器。

1.4  高分辨质谱技术

相较于低分辨质谱只关注若干离子通道，高分辨质谱可以利用检测器超高的分辨率，采用全扫模式，全面的表征被分析物及其潜在代谢物的分子量信息，使定量定性一体化成为可能。

相较与小分子或者多肽，完整蛋白由于其大且复杂的构象，往往需要在离子化过程中施加较大的源内电压，以减少金属离子加合峰，获得更加干净清晰的蛋白质谱谱图。然而，越大的源内电压则意味着更大可能发生的源内裂解，可能破坏蛋白的结构，从而给出偏差的结构信息，这就需要我们结合实际情况，针对性的优化质谱参数，从而获得最有用的实验结果。

完整蛋白的质谱数据分析也需要量体裁衣。如图1中所示，完整蛋白的质谱原始数据呈现形式为多电荷态的分布，我们可以选取其中一个或多个电荷态进行离子谱图提取，从而实现单一或多个组分的定量；也可以借助分析软件，先对原始谱图进行去卷积处理，去除多电荷分布的干扰，利用去卷积后的谱图进行定量。采用何种方法对原始数据进行处理，需要依据实验目的和分析物的性质进行综合考量。综合而言，对于利用高分辨质谱对完整蛋白分析的数据处理，目前业内缺乏明确的法规指导，药明康德DMPK将持续追踪并积极参与行业内新规则的制定。

通过上面四部分的讨论，我们可以看出，成功的完整蛋白的质谱生物分析，一方面需要诸多不可或缺的前置技术；另一方面，对实验室和实验操作人员的要求也是综合且全面的，首先实验室需要配备精密昂贵的高分辨质谱仪，再者实验人员要非常熟悉生物分析的样品前处理，此外，数据的处理和解读也比一般的PK分析更加复杂麻烦。药明康德的大分子生物分析团队在这一领域积累了相当丰富的经验，能够在极短的时间内，保质保量完成客户的检测需求。

二、案例分享

2.1  完整蛋白质谱分析用于单抗类药物(monoclonal antibody)药代动力学研究

抗体类药物的PK研究通常依赖LBA方法或者基于MRM(Multiple reaction monitoring)的LC-MS/MS方法，相关知识在之前的文章中有过详细介绍（基于LC-MS技术的抗体偶联药物（ADC）药代动力学生物分析策略，基于LBA技术的抗体类药物临床前PK生物分析策略与路径）。两种方法各有其优点，但它们共同的缺点在于：不清楚被定量的目标蛋白的具体结构，是否为均一的单一蛋白？还是原始蛋白经过生物转化后形成的多种蛋白结构的混合物？借助LC-HRMS平台，在完整层面上直接对抗体药物进行定量，可以解决以上问题，抗体药物的异质性（比如糖基修饰，潜在的生物转化等等）可以得到接近真实的表征。

图 2. 大鼠基质中完整曲妥珠的定量标准曲线线性范围200-2500 ng/mL

图 3. 利用特征多肽法与完整蛋白定量所得的曲妥珠单抗在大鼠体内的药时曲线对照

在对完整蛋白的数据进行处理的时候，我们特意只选取了G0F/G0F这一单一类型的糖基化修饰的峰进行色谱峰提取定量，最后通过与特征多肽法进行对照，揭示出G0F/G0F清除较快这一现象。对于给药后采集的初始时间点（B）和采集终点(C)数据的对比也揭示出G0F/G0F这一糖型的曲妥珠相对含量的下降。

药明康德DMPK生物分析团队开发并验证了完整蛋白质谱分析用于单抗类药物曲妥珠的PK分析能力。结果如图2中所示，借助高选择性，高回收率的亲和免疫捕获方法与精心优化的RPLC-HRMS分析方法，在使用20-30 μL初始血浆样品的情况下，方法的检测下限0.2 μg/mL，足以支持常规的单抗类药物PK分析。之后我们将该方法用于大鼠样品的PK分析，并与特征多肽法测得的结果进行了对比。在选择了单一糖型G0F/G0F进行定量时，完整蛋白质谱分析法揭示出G0F糖型相对较快的PK清除速度，较低的半衰期，如图3中所示。传统分析方法要实现不同糖型的PK清除速率分析，需要先确认糖基化修饰的位点，然后酶解抗体，再针对被修饰多肽开发质谱定量方法^[5]，完整蛋白分析能够快速直白地呈现出与文献报道吻合的实验结果，而且整个实验过程要简单直接得多。

2.1  完整蛋白质谱分析用于抗体偶联药物（ADC, Antibody-drug conjugates）的生物分析

关于ADC药物，读者可以回顾我们往期的介绍文章，在此，我们将再次介绍，完整蛋白质谱分析技术对于这一特定类型的新分子类型的特殊作用。作为天然就不均一混合的分子，ADC药物的完整蛋白分析具有独特的意义与重要性。这种重要性主要体现在多个方面：

DAR值分布与平均DAR值的检测如图4中所示，对于T-DM1（Trastuzumab emtansine）的完整蛋白质谱分析可以揭示：随着体外孵育时间延长，T-DM1的DAR值分布逐渐向低DAR值区间转移。此外，针对cysteine-conjugated ADC，由于其结构的特殊性，在经典的RPLC酸性流动相下，会发生随机的轻重链的解离，对于这类ADC药物，需要对轻重链分离，对其各自的DAR值分布进行检测，代表性结果如图5所示。

生物转化的检测如图6中所示，对给药后4天后的大鼠血浆中的T-DM1的完整蛋白质谱分析揭示出早期体内发生的生物转化表现为毒素小分子的脱落或毒素小分子与cysteine的交换。

针对DAR值均一的ADC药物，完整蛋白层面的PK分析也将成为可能。比如，新型site-specific连接技术的诞生使得某些ADC的异质性下降到与单抗类药物接近或一致^[6][7]，使得完整ADC的PK分析成为可能。如图7中所示，在文献中^[8]，作者Huang等人通过合成的DAR2， DAR8 ADC，借助完整蛋白分析，成功的绘制出基于特征多肽与完整蛋白分析的不同PK曲线，并揭示出ADC可能经历的体内生物转化。

图4. T-DM1体外血浆稳定性检测结果

随着孵育时间的增加，高DAR值ADC（如图中DAR6即在24 h后消失）含量逐渐下降，相应地ADC的平均DAR值从T0的3.34下降至48 h后的2.21。

图5. 基于RPLC-HRMS的Cysteine conjugated ADC的DAR值表征

对ADC进行简单的还原处理后，进行RPLC-HRMS分析，对所得结果进行去卷积处理，获得轻链与重链各自的DAR值分布，再通过计算获得原始ADC的平均DAR值。

图 6. T-DM1在大鼠体内的生物转化产物鉴定

通过对DAR2相关代谢产物的研究表明，主要的体内生物转化反映为毒素小分子的脱落，通过将给药4天后采集的大鼠血样与T0样品的对照，新峰150214和150324分别对应了毒素分子的脱落与毒素分子与cysteine的交换产物。

图7. 文献8报道不同DAR值的site-specific ADC药时曲线 

(A)DAR0 (25 mg/kg), (B) DAR2(25 mg/kg)与(C) DAR8 (25mg/kg)。  从基于特征多肽的定量方法来看，三种ADC的抗体骨架PK趋势相近，但是基于完整蛋白的分析则揭示出连接了毒素分子的ADC，很容易发生体内的生物转化，对给药后一段时间后的完整蛋白质谱谱图的具体分析则显示，作者指出该毒素分子SG3584在体内会快速水解。

结语

最后，让我们引用Kellie等2021年发表的文章^[9]中的图8作为总结，归纳出目前完整蛋白分析在生物分析当中的经典应用及其实现。可以看出，虽然文章作者将目光聚集在抗体类药物上，这一决策思路其实也可以扩展至其他蛋白，比如对于分子量~ 10 kDa的小蛋白类药物以及寡核酸类药物（“质的飞跃”液相色谱-质谱联用在寡核苷酸药代动力学定量分析中的应用），药明康德DMPK生物分析团队拥有成熟的利用完整蛋白分析实现绝对定量PK分析的策略。

图 8. 完整蛋白分析的代表性案例及其数据分析策略

对于单组分的抗体类药物，可以实现绝对定量，定量时，可以基于单一或多个电荷态的提取离子色谱峰，也可以基于去卷积后的质谱峰，加入内标，还可以改善方法的稳定性与重现性。对于成分稍微复杂，比如具有单一代谢产物的融合蛋白类分析物我们可以采用类似单一抗体的绝对定量法，也可以采用基于去卷积后峰的相对强度，进行半定量分析。对于组分极其复杂，具有超多组分或代谢产物的蛋白类药物，比如异质性强且生物转化复杂ADC类药物，基于去卷积的定性/半定量生物分析的实现则较为现实。

完整蛋白质谱技术在生物分析领域潜力巨大，但是由于方法的前沿性以及相关法规的空白，目前大多是作为经典方法的备选或者补充。但不可以忽视的是，完整蛋白质谱技术有着LBA与特征多肽法所不能比拟的独特优势，即它能够给大分子药物提供类似小分子的代谢产物鉴定、检测能力，且可以对体内样品实现生物转化的检测与表征。而这种对于生物转化的检测能力，随着大分子药物结构越来越复杂，尤其是ADC这种大、小分子偶联的新分子类型的诞生，变得越来越重要，能够更好得帮助我们更好得研究其体外体内的稳定性，及其生物转化情况。

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作者：程剑辉

编辑：李陟昱，方健，钱卉娟

设计：倪德伟