基于LBA技术的抗体类药物临床前PK生物分析策略与路径

抗体类药物是属于生物药的一个大的类别，目前单克隆抗体药物是其药物市场规模的主要构成。自1986年第一个靶向CD3的单抗药物OKT3（Muromonab-CD3）被FDA批准，抗体类药物已经经历了长足的发展。为了更好的避免免疫原性，延长半衰期，以及更好的介导ADCC/CDC效应等药效上的进步，单抗药物经历了最早的鼠源性抗体，到鼠源/人源嵌合抗体，人源化抗体和全人源抗体。随着技术的进步，抗体类药物的发展迅猛，至2015年FDA仅批准了50个单抗药物，而之后短短6年多这个数量就翻倍了，到2021年4月份，FDA批准了第100个单体药物，GSK的PD-1抑制剂dostarlimab。在中国截至2020年底，共获批上市18款单抗药物，仅2020年CDE受理抗体新药上市申请数量高达83例，其中1类抗体新药就占16例。对于大部分抗体类药物，配体结合分析（LBA, ligand Binding Assay）是常用的生物分析手段。本文将从以下几个方面进行介绍，首先介绍丰富多样的抗体类药物主要类型，接着以仪器平台选取，检测形式（Assay format），关键试剂准备为核心讨论基于LBA的PK生物分析的策略与路径。

图1. 抗体类药物的人源化发展路径^[1]

一、百花齐放，多种多样的抗体类药物类型

单克隆抗体（Monoclonal antibody）

是最常见的抗体类药物，2020全球销量最高的药物中有5个是单克隆抗体药物，包括目前销售量最高的药王Humira（Adalimumab）。2021年5月Nature发表一篇综述文章庆祝FDA批准第100个单克隆抗体药物^[2]，也可见对于单克隆抗体药物市场的认可和热度。

图2. 2020销量前十的药物，红色框标记的6款是抗体类药物，除Eylea（FC融合蛋白）外均是单克隆抗体类药物^[3]

为了追求更好的药效和安全性，抗体类药物不断发展，在结构和功能上不断创新，除了传统单克隆抗体外，常见抗体类药物还包括以下几种类型，双特异性抗体/多特异性抗体（Bispecific antibody/Multi-specific antibody），载荷偶联抗体（Payload conjugated antibody），FC融合蛋白（FC fusion protein），抗体片段（Fragment antibody）以及抗体前药（Antibody prodrug）等，如下图所示。

图3. 以单抗为结构基础，常见抗体类药物类型

双特异性抗体/多特异性抗体

是在单克隆抗体的基础上，利用不同的生产平台，形成基于片段，对称或者不对称的抗体，可以靶向复数的表位。其不仅具备单克隆抗体的优势，在设计上也具备桥接功能分子或细胞间的潜力，目前研发也是非常火热，截至2021年5月，有三款双特异性抗体药物被FDA批准，有100多种处在临床研发阶段^[4]。

图4. 双特异性抗体示意图

载荷偶联抗体

主要利用抗体优秀的靶向性质，将希望送达特定目的位点的各类载荷（Payload）通过抗体靶向送达期望药效位置，这里载荷的种类可以是很多种，包括最常见的小分子毒性药物，构成了最常见的药物偶联抗体（ADC）。除此之外，也可以偶联其他类型的载荷，例如偶联放射性核素，即构成核素偶联抗体（RDC，Radionuclide Drug Conjugates），偶联肽段，构成多肽偶联药物（PDC, Peptide Drug Conjugates）以及最近Avidity Biosciences公司的世界首个进入临床阶段的寡核苷酸偶联抗体（AOC, Antibody Oligonucleotide Conjugates）等。目前最成功的ADC类型，截至2021年底已有13个药物上市，其他的偶联药物更多的仍处于设想或临床前阶段，临床价值能否实现仍有待观察。

图5. 抗体偶联药物ADC示意图

FC融合蛋白

是融合蛋白药物的一种，指利用基因工程技术将免疫球蛋白（IgG、IgA等）的Fc段与某种具有生物学活性的功能蛋白分子融合而产生的新型蛋白。Fc融合蛋白不仅可发挥所融合蛋白的生物学活性，还具有一些抗体的性质，并且可以延长药物在血浆内的半衰期，降低药物的免疫原性等功能，2020年全球销量第五位的阿柏西普Eylea（Aflibercept）就是一个FC融合蛋白药物，其功能蛋白抑制VEGF-A，VEGF-B和PlGF的活性，起到类似贝伐珠单抗（Bevacizumab）作为VEGF抑制剂的功能。

抗体片段

是全长抗体的一部分，其保留了完整单克隆抗体的特异性，类型通常包括抗原结合片段（Fab, Fragment antigen binding），单链可变区片段（scFv, Single-Chain Fragment Variable），单域抗体（sdAb, Single-domain antibody）。由于分子大小相对全长抗体更小，抗体片段通常在药代动力学特性上具备更好的组织或者肿瘤的穿透性。截至2021年1月，有四款抗体片段药物上市^[5]。

抗体前药

和化学类前药概念类似，都指需要经过体内代谢后才能行使生物学功能的一类药物。对于抗体前药，通常这样的设计往往是为了避免行使药效的抗体（或其融合的效应蛋白）本身的毒性，将副作用较大的结构区域通过一个保护性结构Mask（通常是一段蛋白序列）包裹起来，在靶位点被相关蛋白酶切割后具备生物学活性。伴随着设计平台的不同，抗体前药的类型有很多种，目前仍没有上市的药物，但其相关研究也在不断推进中。

大部分抗体类药物的生物分析都是通过基于免疫分析（Immune assay）的手段，更广义的而言，是配体与受体结合的配体结合分析（LBA, ligand binding assay）的范畴。对抗体类药物的生物分析，基于LBA的免疫分析法是最常用手段，但随着液质联用（LCMS, Liquid Chromatography Mass Spectrometry）技术特别是高分辨质谱（HRMS, High-Resolution Mass Spectrometry）的发展，基于特征性肽段（Surrogate peptide）和完整蛋白（Intact protein）的分析方法对于结构复杂的抗体类药物有其独特的优势，例如药物偶联抗体（ADC, Antibody Drug Conjugate），抗体前药，多特异性抗体等。此前我们已经发布了专题文章：基于LC-MS技术的抗体偶联药物（ADC）药代动力学生物分析策略，欢迎阅读。

二、各具特色的LBA仪器平台

首先在仪器平台选取上，应当充分考虑到各类LBA平台的优势和局限性，这里以几种常用的LBA平台为例介绍，例如基于酶联免疫吸附的ELISA平台，基于电化学发光的MSD平台，基于微流控技术的Gyrolab平台和基于单分子阵列分析的SIMOA平台。下图见几种常见平台在检测灵敏度（考虑MRD稀释因子），检测动态范围，样本体积消耗，方法开发容易程度，分析通量和耗材成本上的比较。

图6. 不同LBA平台的比较，*到*****代表较差到优秀的分级，分级仅供参考，具体请以厂商参数说明为准

ELISA平台是最常见也是应用最广泛的LBA检测平台，可以满足大部分临床前抗体类药物生物分析的需求，其他平台也具备其独特的优势。总体而言在平台的选择上应当遵循以目的为导向（Fit for purpose）的选取方式，根据所需灵敏度，动态范围，可用样本体积，样本数量等，选取合适的分析平台。

例如在灵敏度选择上，可以根据实际动物给药剂量和代谢速度估算方法需要达到的灵敏度要求，或者在分析通量选择上，根据潜在样本数量和数据提供周期的需求，选择合适的平台。

三、以目的为导向设计合适的检测形式（Assay format）

检测形式指通过何种方式定量这个药物，或者说具体检测抗体类药物的哪个部分（或结构域）。为了满足方法特异性，灵敏度和对基质干扰的抵抗性，对于抗体类药物的生物分析通常使用夹心法（Sandwich assay）或其相应变种。在检测形式的确定上要考虑多种因素，包括但不限于方法特异性（Specificity），配体耐受性（Tolerance）以及完整性（Integrity）等。

方法特异性

方法特异性从广义上划分，可以分为通用性方法（Generic Assay）或者特异性方法（Specific Assay）。

通用性方法通常是检测抗体类药物的非可变区，例如其重链或者轻链的保守区域，这类方法具有设计简单，通用性强等优点，但同时也无法区分具有相似保守区域的抗体类药物，方法往往不具备转移到临床实验的可能，往往应用于早期临床前抗体药物筛选实验中。

特异性方法通常检测了抗体类药物的独特性区域，可以区分具有相似保守区域的抗体类药物，能满足新药临床研究注册申报（IND, Investigational New Drug）实验中对于方法特异性（Specificity）的要求，方法也具备转移到临床实验的可能。

配体耐受性

配体耐受性也是检测形式确定中的重要考虑因素，如果这个抗体类药物是针对血液循环中的可溶性靶点，在确定检测形式中需要考虑配体（Ligand）和药物的结合，针对其可产生的多种分子形态，如游离配体，游离药物（Free drug），结合的配体和药物，总药物（Total drug）等，根据药物开发阶段的需求，开发相应的生物分析方法，寻找合适的试剂对。

完整性

完整性指抗体类药物等大分子生物药在生理状态下其结构的完整情况，对于新颖的融合蛋白，双/多特异性抗体，ADC药物，以及抗体前药等。其结构上的完整性直接和药物的安全性和有效性挂钩。例如双特异性抗体，如果其行使功能是通过桥接T细胞和肿瘤细胞完成，在分析上需要考虑特异性两端的完整性，设计合适的检测形式。又例如抗体前药，如果其在设计上通过一段序列保护效应端，效应端发挥药效需要剪切掉保护序列，这样情况下，为了更好评估安全性和药效，我们设计检测形式时，需要考虑到能分别检测到被剪切后的药物和完整的药物。

在考察抗体类药物的完整性时，由于可用试剂和免疫测定方法的局限，LBA方法可能不足以表征复杂抗体类药物的分子物种（Molecular species），这时候LC-HRMS或者hybrid LBA/LCMS技术可以给出分子结构完整性上的更多信息。例如对于ADC药物，基于LC-HRMS的完整抗体分析技术可以给出ADC药物DAR值分布的信息，便于了解ADC药物结构稳定性。

四、契合实验需求的关键试剂准备

选取合适的关键试剂对于基于LBA的生物分析至关重要。通常在确定了检测形式（Assay format）后，就需要根据被检测的具体结构域，选择可用的试剂对，通常可用于抗体类药物生物分析的关键试剂包括配体（Ligand），抗独特型抗体（Anti-idiotypic antibody）以及抗IgG保守区域抗体等。

由于有大量商品化试剂可用，通常在临床前生物分析中使用最多的是配体和抗IgG保守区域抗体，方法设计比较简单，试剂准备周期短。但是使用配体作为关键试剂，可能会在分析特定类型抗体类药物时存在一些问题，比如分析靶向体内的游离靶点的抗体类药物时，使用配体检测的是游离的药物（Free drug），而不是总药物（Total drug）。因此在关键试剂准备中，会考虑制备抗独特型抗体。简单而言抗独特型抗体指能结合药物可变区（其独特型）区域的抗体，通常分为中和型，非中和型和药物靶点复合型三种（如下图）。中和型抗独特型抗体类似于配体，可以检测游离的药物，非中和型抗独特型抗体类可用于检测总药物，而药物靶点复合型则检测结合的配体和药物。可以根据实际需求选取制备合适的抗独特型抗体。药明康德Hits事业部具有丰富的抗独特型抗体制备经验，可以满足不同的实验需求。

图7. 抗独特型抗体的不同类型

结语

药明康德DMPK部门具备丰富的临床前生物分析经验，目前在大分子生物分析上，已承接了大量抗体类生物药的药代动力学生物分析工作，实现了对主要热门抗体靶点的分析经验全覆盖，并且对于新兴类型的抗体类药物的生物分析，例如双/多特异性抗体，ADC，抗体片段，抗体前药等都积累了丰富经验。可以帮助客户快速完成临床前生物分析方法的建立和确证，满足药代动力学的FDA/NMPA/TGA的IND申报要求。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：周毛天

编辑：李陟昱，邢丽丽，方健，钱卉娟

设计：倪德伟