“罕见”CYP酶体系如何完善酶表型鉴定？

药物相互作用（Drug-drug interaction, DDI）指的是同时使用多种药物时，药物之间产生的药代动力学和药效动力学改变。在药物相互作用中，存在着“施害药”与“受害药”，前面的文章中以代谢酶诱导研究（解读 | NMPA，FDA药物相互作用研究技术指导原则（一）──代谢酶介导的药物相互作用评估策略）为例描述过评估候选化合物成为“施害药”的可能性，本文主要结合指导原则的变更描述如何更完善地评估参与作为“受害药”的候选化合物代谢的主要代谢酶。据报道约75%的上市药物主要通过代谢途径从体内清除，其中约48%的药物经细胞色素P450（Cytochrome P450, CYP）酶代谢，各CYP贡献占比约1%-40%，CYP3A占比最大；约24%的药物经非CYP代谢。因而本文着重讨论如何建立“罕见”CYP酶鉴定体系，以完善CYP酶表型研究。

主要从以下几个方面来介绍如何完善候选化合物的代谢酶表型鉴定

1. 缘何需要建立更完善的评估体系

2. 何时需要开展“罕见”CYP酶鉴定

3. 如何建立“罕见”CYP酶的鉴定体系

4. “罕见”CYP酶鉴定体系建立的结果展示

5. “罕见”CYP酶鉴定体系的应用

一、缘何需要建立更完善的评估体系

一个化合物若以代谢作为体内主要的清除途径，且参与代谢的酶种类较为单一，那么发生显著药物-药物相互作用的概率就会越大。因此，药物代谢酶表型鉴定研究（Phenotyping, PNT）是临床前药物代谢研究中的重要内容之一。

01 从指导原则的迭代看CYP酶研究范围           

2006年，美国FDA将CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A纳入PNT的考察对象；2012年，PNT的考察对象分为两个梯度：梯度1，常规的7CYPs酶（即CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A）；梯度2，“罕见”CYPs酶（未明确指出哪些酶）和Non-CYPs的I相代谢酶（如FMO，AO，XO等）；2020年，FDA终稿文件中提出，体外表型实验先对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A进行常规评估，以确定哪些酶参与了受试化合物的代谢。如果以上的酶没有显著催化受试化合物的代谢，则建议进一步确定哪些额外的酶参与了代谢，这些额外的酶包括但不限于：

1）“罕见”CYP酶，包括CYP2A6、CYP2J2、CYP4F2和CYP2E1

2）其他的I相代谢酶

3）II相代谢酶

02 “罕见”酶也可以是“主代”酶

指导原则（2020）中指出，根据体外药物代谢酶表型研究和人体药代动力学数据，如果某一特定的代谢酶对受试药物的清除占25%以上的比例，那么认为该酶对受试药物的清除具有显著贡献。在这种情况下，应该使用该酶的强抑制剂和诱导剂进行临床药物-药物的相互作用研究。故找到受试药物主要代谢酶在药物-药物相互作用中尤为关键。

随着小分子实体的越来越多，除了常规的7CYPs酶，一些“罕见”CYP酶（如CYP2A6、CYP2J2、CYP4F2、CYP2E1和CYP3A5）也在药物代谢中扮演主要代谢酶的角色。如上市药物盐酸芬戈莫德（Fingolimod Hydrochloride、商品名：Gilenya）或在研药物吉西他滨的前药（Compound-3）。

结合指导原则，上市药物及在研药物的研发趋势及各CYP酶在肝脏中表达丰度，参与药物代谢的概率，我们确定本次“罕见”CYP酶考察范围为：CYP2A6、CYP2J2、CYP4F2、CYP2E1和CYP3A5。

二、何时需要开展“罕见”CYP酶鉴定

用于CYP酶表型鉴定的方法主要有化学抑制法、重组人源CYP同工酶法、抗药物代谢酶抗体法和相关性分析，现阶段主要以前两种实验手段为准。

化学抑制法：通常在加入与不加入一系列CYP酶亚型选择性化学抑制剂的情况下，分别测定人肝微粒体对药物的代谢活性。考察人肝微粒体中CYP酶亚型被选择性抑制后，药物代谢的受影响情况，常以相对抑制百分率表示。

重组人源CYP同工酶法：分别测定一系列CYP同工酶对药物的代谢速率，并比较不同CYP同工酶（酶亚型）对药物的代谢活性。通过代入相应CYP酶亚型在微粒体中的含量进行计算，评价每一种CYP酶亚型对药物代谢的相对贡献率。

一般情况下，结合化学抑制法及重组人源CYP同工酶法的实验结果以表征受试化合物或其代谢产物的主要代谢酶。但在实际研究中，化学抑制法及重组人源CYP同工酶法实验结果可能会存在相互矛盾的现象，不能明确得出药物代谢的主要酶。在这种情况下，我们需要开展“罕见”CYP酶表型鉴定研究。

三、如何建立“罕见”CYP酶的鉴定体系

本次研究从酶生物学特性出发，选择酶相应的特异性底物，测定底物的相关参数，建立稳定，可靠，可重复的“罕见”CYP酶PNT检测体系。下面主要以CYP3A5及CYP2J2为例，介绍“罕见”CYP酶PNT体系搭建的相关考量。

01 例1

CYP3A5属于CYP3A家族，与CYP3A4共同参与大部分药物的代谢，并在其中起主要作用（图1）。CYP3A5也是肝脏中表达丰度最高的CYP酶之一（图2），故CYP3A5需要被单独进行研究。

图1：参与临床药物代谢的CYP450酶的比例

图2：CYP450酶表达丰度

相关文献对CYP3A5的研究路径（图3）已进行报道，当体外表型实验结果表明，受试化合物或其主要初始代谢产物的代谢酶为CYP3A时，受试化合物或其主要初始代谢产物建议开展关于CYP3A4/3A5的表型鉴定实验。首先在重组酶CYP3A5体系中进行考察，其次采用某些抑制剂（如CYP3cide）佐证这一实验结果，详细见下方流程图。因CYP3A4与CYP3A5的氨基酸同源性高达84.1%，底物具有高度的重合性。故我们从底物的敏感性出发，发现Midazolam对CYP3A5的亲和力较强，故选择Midazolam作为CYP3A5的底物，测定Midazolam的代谢产物1-Hydroxymidazolam的酶促动力学参数（Km），从而建立CYP3A5重组酶检测体系。

图3：CYP3A5研究流程图

02 例2

CYP2J2 mRNA的表达水平在小肠，心脏中最高，在肝脏中表达水平相对较低。CYP2J2与CYP3A4的活性空腔存在部分的重合（图5），底物具有一定的相似性；其次，酮康唑（Ketoconazole）作为CYP3A的阳性抑制剂，在一定条件下，也会抑制CYP2J2的活性，以上两点给体外酶表型鉴定实验（Phenotyping, PNT）带来挑战。本研究以文献提供的Astemizole作为CYP2J2的表征性底物，测定其固有清除率（CLint），建立CYP2J2特有的重组酶检测体系，以获得更准确的体外酶表型鉴定实验结果。

图4：CYP2J2活性位点空腔(A)，CYP3A4活性位点空腔(B)，CYP2J2与CYP3A4重叠的活性位点(C)

其余“罕见”CYP酶（CYP2A6、CYP4F2和CYP2E1）均是测定其特异性底物代谢产物的酶促动力学参数（Km），建立对应的重组酶检测体系，相关实验设计过程不再做详细描述。

四、“罕见”CYP酶鉴定体系建立的结果展示

在优化的线性条件下，我们测定CYP2A6、CYP4F2、CYP2E1和CYP3A5特异性底物代谢产物酶促动力学参数（Km）及CYP2J2特异性底物固有清除率（CLint），具体实验结果如下表（见表1-表2）。根据文献中通用的两倍判断范围为标准，CYP2A6、CYP4F2、CYP2E1、CYP3A5和CYP2J2的检测值接近于文献报道值或在文献报道值范围内。由此，我们建立了WuXi AppTec“罕见”CYP酶检测体系。

实验结果展示如下：

注：蓝点代表WuXi AppTec检测值，红点代表文献值

注：蓝点代表WuXi AppTec检测值，红点代表文献值

CYP2J2文献中重组酶浓度为100pmol/mL，WuXi AppTec采用此条件，对药物（Astemizole）清除率进行研究，发现在5min内，该药物的剩余量已小于10%，可能存在固有清除率低估的情况。WuXi AppTec调整了酶浓度，测得的药物（Astemizole）固有清除率高于文献值。

五、“罕见”CYP酶鉴定体系的应用

01 应用案例1

对于Compound A的初始代谢产物M1的生成，特异性化学抑制法及重组人细胞色素P450酶代谢法实验结果存在相互矛盾的现象。特异性化学抑制法实验结果表明，CYP3A是代谢产物M1的主要代谢酶；但是，重组人细胞色素P450酶代谢法实验结果表明，CYP2C8是代谢产物M1的主要代谢酶。后期加入了“罕见”酶（CYP3A5）的考察，重组人细胞色素P450酶实验结果表明：Compound A的代谢产物M1的主要代谢酶是CYP3A5，CYP2C8仅作为代谢产物M1的次要代谢酶，此结果与化学抑制法完全一致，下图主要展示以重组酶为基质，考察每个CYP酶对产物生成的贡献率。

图5：7CYPs对代谢产物M1生成的贡献比例

图6：8CYPs对代谢产物M1生成的贡献比例

02 应用案例2

对于Compound B的主要代谢产物M1的生成，特异性化学抑制法及重组人细胞色素P450酶代谢法实验结果存在相互矛盾的现象。特异性化学抑制法实验结果表明，CYP3A是代谢产物M1的主要代谢酶；但是，重组人细胞色素P450酶代谢法实验结果表明，CYP2C9是代谢产物M1的主要代谢酶。结合“罕见”CYP酶的生物学特性，加入“罕见”CYP酶（CYP3A5、CYP4F2和CYP2J2）的考察，发现CYP2J2才是代谢产物M1的主要代谢酶。下图8主要展示以重组酶为基质，考察每个CYP酶对产物生成的贡献率。下图9主要展示以重组酶为基质，代谢产物M1在CYP2J2与CYP2C9中的相对生成速率的比值。

图7：7CYPs对代谢产物M1生成的贡献比例

图8：M1在重组酶CYP2J2与CYP2C9中相对生成速率的比值

以上两个案例表明：“罕见”CYP酶体系的加入进一步挖掘PNT研究中隐藏的一些重要信息，为受试药物临床实验设计提供更可靠的依据。

结语  

药物代谢酶表型鉴定研究（Phenotyping, PNT），结合化学抑制法和重组人源CYP同工酶法，鉴定出参与药物代谢的相关酶表型，为先导化合物的结构优化、候选化合物的临床实验设计提供重要的依据，是临床前药物代谢研究的中重要考察内容之一。通过以上的研究，药明康德DMPK成功的搭建了“罕见”CYP酶鉴定体系，优化了药物代谢酶表型研究（Phenotyping, PNT），更准确的找到参与药物代谢的CYP酶。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：刘欢，姜丽芳，鞠武建，陈根富

编辑：钱卉娟，方健

设计：倪德伟