在药物的吸收、分布、代谢和排泄过程中，需要关注的一个很重要的问题就是药物与代谢酶之间的相互作用。常见的参与药物代谢的酶中，占比最大的是CYP酶，它主导药物的Ⅰ相代谢过程。UGT酶（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶）占比第二，是人体Ⅱ相代谢中最重要的酶之一，参与着很多药物的代谢清除过程。UGT酶利用葡萄糖醛酸为糖基供体，广泛催化内源性（如胆红素、脂肪酸、甾体类激素、食物中的化合物、药物、环境污染物等）和外源性化学物质发生结合反应，通常结合反应后的化合物更具水溶性，易于排出体外，从而起到解毒的作用。
但是这类结合反应存在一种特殊情况，即结合位点发生在羧基上，形成潜在的毒性代谢物──酰基葡萄糖醛酸代谢产物，在代谢产物安全性评价（MIST）的指导原则中（扩展阅读：一文读懂：FDA药物代谢产物安全性试验技术（MIST）指导原则），特别提出需要额外关注酰基葡萄糖醛酸代谢产物的安全性。当药物中存在可以生成酰基葡萄糖醛酸的羧基结构时，就需要提高警惕，它在代谢过程中是否会形成酰基葡萄糖醛酸代谢产物？如果形成酰基葡萄糖醛酸代谢产物是否会引发毒性？本文将介绍酰基葡萄糖醛酸代谢产物产生毒性的机制，如何识别酰基葡萄糖醛酸代谢产物，以及如何评估酰基葡萄糖醛酸代谢产物的毒性，为可能产生酰基葡萄糖醛酸类代谢物的药物研发提供依据。
一、酰基葡萄糖醛酸代谢产物产生毒性的机制
UGT酶全称尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶，UGT酶的辅助因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），图1是UGT酶催化UDPGA转移葡萄糖醛酸结构与化合物结合的反应过程。人体内目前发现的UGT酶分为四个家族，共有22种亚型[1]（如表1所示）。
图1. UGT酶催化的反应过程
表1. UGT酶亚型分类
UGT酶催化下，化合物结合葡萄糖醛酸形成极性较大的代谢产物，这类代谢物在体内的循环过程如图2所示[2]，结合产物可以在肠道中β-葡萄糖醛酸水解酶的作用下，部分变回原形药，排出体外或经肠壁重吸收进入体循环。而针对酰基葡萄糖醛酸代谢产物，还有一部分则可能在肝细胞和肠上皮细胞中与蛋白结合，形成蛋白加合物，从而诱发毒性。
图2. 酰基葡萄糖醛酸代谢产物在体内的循环过程
而酰基葡萄糖醛酸代谢产物产生毒性的具体机制，如图3所示[3]：羧基通过UGT酶的代谢形成1-O-β-酰基葡萄糖醛酸，其结构中的羰基碳原子具有亲电活性，而蛋白的氨基酸残基中SH/OH/NH2作为亲核基团，进攻碳原子发生转酰基（transacylation）反应，同时葡萄糖醛酸脱落。1-O-β-酰基葡萄糖醛酸正是通过这种“转酰基”形成了蛋白质—药物的加合物(protein-drug adducts)，从而诱发毒性反应的发生。UGT酶催化形成的1-O-β-酰基葡萄糖醛酸不稳定，会发生分子内部可逆的重排，形成2-O-β-、3-O-β-或4-O-β-酰基葡萄糖醛酸迁移异构体。分子内重排形成的迁移异构体通过瞬间开环形成链状醛基结构，开环形成的醛基结构会与蛋白的氨基酸残基的NH2结构形成亚胺结构，并通过重排形成稳定的蛋白加合物，诱发毒性反应的发生。通过这样的方式形成加合物的过程，称为“糖化”(glycation)。
图3. 酰基葡萄糖醛酸代谢产物产生毒性的机理
二、如何识别酰基葡萄糖醛酸代谢产物
如果化合物中包含羧基、醇羟基或氨基等可能与葡萄糖醛酸结合的位点，就需要判断葡萄糖醛酸结合代谢产物是否是酰基葡萄糖醛酸代谢产物。准确鉴定酰基葡萄糖醛酸代谢产物，需要将其分离纯化经NMR确定结构，但是研究周期较长，为满足快速筛选化合物的需要，以下提供一种实验方案以帮助识别酰基葡萄糖醛酸代谢产物：
Step 1 : 捕获实验 [4]
利用酰基葡萄糖醛酸代谢产物产生毒性的机制反向识别，基于酰基葡萄糖醛酸代谢产物可以与蛋白结合的特性，可以设计一个捕获实验（如图4）来识别：在常规的添加UDPGA的肝微粒体孵育后，去除微粒体蛋白，上清中加入肽段进行捕获实验，用已知结构的包含赖氨酸NH2的肽段，代替可能结合的蛋白，捕获具有结合活性的酰基葡萄糖醛酸产物。
Step 2 : 质谱识别 [4]
通过高分辨质谱搜索连接有特定肽段的结合产物，可以反向验证是否形成了酰基葡萄糖醛酸产物。同时肽段捕获的加合物在质谱中会形成特征性的碎片m/z 470（如图4）。碎片m/z 470是从碳基处断裂，所以这个碎片是葡萄糖醛酸部分带走了药物分子结构中的一个O。这个特殊的碎片可以直接用于与N-葡萄糖醛酸结合物进行区分。
图4. 捕获实验蛋白加合物质谱解析
三、如何评估酰基葡萄糖醛酸代谢产物可能产生的风险
并非所有的酰基葡萄糖醛酸代谢产物都会引发毒性，所以在确定化合物形成酰基葡萄糖醛酸代谢产物之后，下一步就需要评估它是否会引发毒性。在药物开发过程中尽早地评估酰基葡萄糖醛酸代谢产物的毒性，可以帮助制定开发策略，规避风险或减少损失。
酰基葡萄糖醛酸代谢产物引发毒性的机制中，首先形成的1-O-β-酰基葡萄糖醛酸不稳定，在体内会发生分子内可逆的重排，形成2-O-β-、3-O-β-、或4-O-β-酰基葡萄糖醛酸迁移异构体。这是一个动态的过程，所以通过识别酰基葡萄糖醛酸中所提到的捕获实验，将这动态过程固定下来，然后通过质谱数据鉴定迁移前后的化合物，最后得到一个确定的比率：迁移率（AG%）=迁移后峰面积/迁移前峰面积[4]。
图5. 酰基葡萄糖醛酸蛋白加和物迁移率计算
文献[4]总结了7个化合物的迁移率，结果显示迁移率较高的两个化合物，因临床应用产生毒性反应，已退出市场；迁移率第三的化合物研究也发现可引起肝细胞损伤；迁移率较低的布洛芬则是目前使用的很安全的非甾体抗炎药。这个结果推测随着迁移率的增加，酰基葡萄糖醛酸代谢产物的毒性也随之增加。
文献中并未给出确切的引起毒性的迁移率cutoff值，但是仍然可以作为评估酰基葡萄糖醛酸代谢产物安全性的一项指标，在药物开发过程中，应用文中提供的迁移率评价的策略，通过与已上市药物的平行比较迁移率，可以提供酰基葡萄糖醛酸代谢产物安全性评估的依据。
图6. 七个化合物迁移率计算结果
四、评估葡萄糖醛酸代谢产物引发安全性风险的策略
UGT酶是重要的药物代谢酶，参与很多药物的清除和解毒过程，而由于酰基葡萄糖醛酸代谢产物具有结合蛋白的能力，存在安全性风险，需要对其做额外的安全性评测。
第一步需要鉴定是否形成了酰基葡萄糖醛酸
除NMR测定以外，可以通过肽段捕获酰基葡萄糖醛酸这类具有活性的代谢物，并结合质谱数据的鉴定，确定酰基葡萄糖醛酸产物的生成。
第二步提供迁移率的计算
帮助评估酰基葡萄糖醛酸代谢产物的潜在毒性，对于具有形成酰基葡萄糖醛酸代谢产物风险的化合物，尽早地评估化合物形成酰基葡萄糖醛酸代谢产物的能力和迁移率，可以帮助规避开发过程中存在的风险。
图7. 酰基葡萄糖醛酸代谢产物的研究策略[5]
结语
在UGT酶参与的药物代谢过程中，科学家往往关注较多的是药物快速清除、暴露量降低以及UGT酶引起的酶表型鉴定等问题。而除解毒作用以外，特定的葡萄糖醛酸结合产物还会引发安全性问题，针对可能引发毒性的酰基葡萄糖醛酸代谢产物，可能会导致药物研发的意外甚至终止。通过多肽捕获、高分辨质谱鉴定等的方法，可以帮助识别酰基葡萄糖醛酸代谢产物，并评估其潜在的安全性风险，从而降低药物研发的风险。
药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。
点击此处可与我们的专家进行联系。
作者：郁贤庆，蔡婷婷，曹卫群，张玲玲
编辑：方健，钱卉娟
设计：倪德伟
参考
[1] 杨帆. 人类UGT酶对药物等外源物质的代谢研究[D]. 天津大学, 2018.
[2] T.R. Van Vleet, Hong L., Anthony L., et al. Acyl glucuronide metabolites: Implications for drug safety assessment[J], Toxicology Letters 272 (2017) 1–7.
[3] 谢彤, 梁燕, 郝海平, 等. 葡萄糖醛酸转移酶(ugts)诱导羧酸药物代谢激活的研究进展[J]. 药学学报，2009(11), 1193.
[4] Jianyao W, Margaret D, Fangbiao L, et al. A Novel Approach for Predicting Acyl Glucuronide
Reactivity via Schiff Base Formation: Development of Rapidly Formed Peptide Adducts for LC/MS/MS Measurements[J], Chem. Res. Toxicol., 2004, 17(9): 1206-1216.
[5] Sophie L, James L. M., Thomas G. H., et al. Acyl Glucuronides: The Good, The Bad and The Ugly[J], Biopharm. Drug Dispos. 2010, 31: 367–395.
加入订阅
获取药物代谢与药代动力学最新专业内容和信息
