体外透皮试验（IVPT）在皮肤外用制剂开发中的应用

早在公元前3000年，古埃及人（图1）和古巴比伦人就常将动物、矿物或植物提取物涂抹在皮肤上以达到治疗作用^[1]。随着现代药物的变革发展，直至1979年，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准了首个作用于全身的经皮给药系统(Transdermal Drug Delivery Systems,TDDS）制剂——东莨菪碱贴片，成为TDDS的标志性事件，并由此开启了TDDS的新篇章^[2]。

图1. 古埃及医生El'wn手持药物^[3]

与传统的给药模式相比，TDDS表现出显著的优势。TDDS可避免肝首过效应；通过非侵入性的给药方式，增加患者用药顺应性；可长期维持稳定的血药浓度，以达到长效治疗的目的^[4]。目前，评估药物经皮给药的方法分为两类：体内法和体外法。已有较多的试验数据表明模拟体内条件进行体外试验研究，即体外透皮试验（In Vitro Permeation Testing, IVPT），获取的数据与常规体内试验具有同等重要的参考价值^[5]。本文将从IVPT的应用场景、相关指导原则要求、皮肤模型的构建以及常用试验参数设计四个方面介绍IVPT，并通过一个验证试验展示了IVPT在制剂筛选方面的应用。

一、体外透皮试验（IVPT）的应用

相对于传统的体内试验，IVPT可以通过精确测量化合物在各皮肤层（图2）中的分布、渗透量和渗透速率，来探索早期吸收阶段的皮肤渗透性差异。该方法可以避免使用活体动物，并且对多个相同或不同的化合物进行多次重复测试，特别适用于比较化合物不同制剂的经皮给药筛选试验。另外，IVPT研究对于评估外用产品的生物等效性（Bioequivalence, BE）也至关重要。结合体外释放试验（In Vitro Release Testing, IVRT）结果，可以为皮肤局部外用药物处方等同性评价中的微观结构特性（Q3）的等同性评价提供重要的证据。

图2. 人体皮肤结构示意图^[6]

IVPT试验常见的应用范围包括: 

1. 辅助早期化合物的筛选

2. 皮肤外用制剂的配方开发和优化

3. BE和生物利用度评估

4. 药品或化妆品的安全性评估

二、相关指导原则要求

2021年3月， 中国国家食品药品监督管理局药品评审中心（Center for Drug Evaluation, CDE）发布了《皮肤外用化学仿制药研究技术指导原则（试行）》，明确了体外透皮试验的设计目的是模拟外用药物在生理条件下的透皮过程，以反映外用制剂的质量。在试验设计方面，相比于2018年发布的《新注册分类皮肤外用仿制药的技术评价要求（征求意见稿）》，新版指导原则删除了原附件的内容，并提出“体外透皮试验建议参考国内外相关指导原则开展相关研究工作”^[7]。

图3. 《皮肤外用化学仿制药研究技术指导原则（试行）》发布通告

以下是目前全球主要监管机构对于相关指导原则的主要的关注点^[8-10]：

皮肤类型

在FDA和欧洲药品管理局（European Medicines Agency, EMA）的指导原则中，仅规定了人离体皮肤作为IVPT的试验模型，而日本医药品医疗器械综合机构（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, PMDA）则允许使用动物的离体皮肤进行试验。

试验时间

在EMA和PMDA的指导原则中均推荐试验时间不超过24 h，而在FDA的文件中该试验进行了48 h。

采样频率

FDA推荐至少8个非零的采样时间点；EMA推荐至少6个采样时间点；而PMDA推荐终点在内共计5个以上的取样点。

试验装置选择、皮肤温度控制

在试验装置选择、皮肤温度控制等参数方面，各指导原则的差异不大。

表1. 体外透皮试验相关指导原则

各指导原则的试验设计在实际应用时，还应综合考虑实际的实验目的和条件。在中国申报中，由于皮肤来源的限制，通常参考PMDA的相关设计。

三、如何选择和构建合适的皮肤模型

在皮肤材料的准备中，种属的选择是首先要面对的问题。虽然人离体皮肤是IVPT试验的金标准，但由于伦理及获取困难等原因，通常选取动物皮肤替代人离体皮肤来进行体外透皮试验。

目前的文献报道中，猪皮是和人类皮肤最为相似的，包括相似的角质层，表皮厚度及毛囊密度等^[11,12]。不同种属动物皮肤的特点对比见下表2。

表2. 不同动物种属皮肤特点的比较^[11,12]

啮齿动物的皮肤是最容易获取的材料。然而，由于脂肪比例、毛囊密度等结构上的差异，药物在啮齿动物离体皮肤中的渗透参数高于人离体皮肤，从而导致对药物吸收的高估^[13]。因此，在IVPT试验中首选的皮肤是和人类皮肤相似的巴马小型猪的离体皮肤。目前IVPT试验常用的皮肤模型如下表3。

表3. IVPT试验常用的皮肤模型

四、试验常用装置及参数设置

体外透皮试验常用的设备如下图4所示，包括垂直式静态扩散池（Static Cell, SC） 和流通式扩散池（Continuous Flow Cell, CFC）^[14]。流通式扩散池具有连续流动的接收液，以模拟体内血液的流动情况，但由于新参数的引入，需要进行更多的预试验来确定相关试验参数。垂直式静态扩散池具有固定体积的接收室，试验过程中持续搅拌接收液，是目前最常用的扩散池装置。

图4. 常用扩散池示意图（SC：左，CFC：右）

使用扩散池进行试验需要一个合适的参数设置，图5描述了在SC中进行IVPT试验的一个典型的试验参数设置^[15]。该试验设计基本符合FDA《Draft Guidance on Acyclovir》中的要求，例如每组供体数量大于4个、每个供体重复数大于4个、试验期间需要设置至少8个采样时间点、单次给药且给药量在5-15 mg/cm²等。对于BE试验参数的选择，需要在关键试验前对试验方法进行开发和验证。

图5. IVPT试验设计中的参数设置^[15]

五、验证试验

化合物A是一种应用广泛的非甾体抗炎药，系统给药后吸收和清除非常迅速，半衰期短。以化合物A为模型的药物，通过使用巴马小型猪背部皮肤在垂直Franz扩散系统（PermeGear, Inc.）上评估6种不同制剂条件下药物的体外透皮过程，为进一步的处方优化提供依据。试验中，第1组为澄清溶液制剂，第2组为商品化的凝胶制剂，第3、4、5、6组为自主筛选的泊洛沙姆制剂。

表4. 各组制剂处方

试验前，选取巴马小型猪背部皮肤，并将皮肤厚度定量至750 μm。将处理好的皮肤角质层朝上置于供体室和受体室之间，并筛选经表皮水分丢失量（Transepidermal Water Loss, TEWL）合格的皮肤用于试验。单次给药1.16% w/w的化合物A制剂。在试验期间，模拟正常皮肤温度条件，皮肤温度保持在32±1°C。在预定的时间点从接收室采集接收液（200 μL）。试验结束后，清洗并剥离角质层，收集表皮和真皮以测定化合物在皮肤中的分布。试验结果如图6、图7所示。

图6. 各组制剂的累积渗透量（左）及渗透速率（右）随时间变化图

图7. 给药后24 h，化合物A在表皮（左）和真皮（右）中的滞留量

图6的结果显示垂直Franz扩散系统对不同制剂的经皮渗透特点具有很好的区分度，例如相比于第1组的澄清溶液制剂，第2组商品化的凝胶制剂显著降低了药物的渗透速率和渗透量。对于4种泊洛沙姆制剂，不同溶媒的配比均改变了药物的透皮特性，为后续制剂筛选优化打下了坚实的基础。图7显示了给药后24 h，各组制剂中化合物A在表皮和真皮皮内的滞留量。含有泊洛沙姆的制剂组（第3 - 6组）中，化合物A的表皮和真皮皮内滞留量显著降低。

结语

TDDS一直广受研究人员和制药企业的关注，然而开发高质量的透皮剂型仍然颇具挑战性。药物的经皮吸收是一个多因素多步骤的过程，体外经皮渗透的结果也受多种因素影响，包括动物来源、皮肤类型、皮肤预处理步骤、待测化合物的理化性质和递送系统等。近年来，各国陆续发布了一些法规和指导原则以规范皮肤外用制剂的开发。作为一个研究工具，IVPT不仅能在外用制剂的仿制药评价中提供Q3的有力支持，也能在化合物筛选及溶媒配方优化中提供一定的参考价值。随着未来更多渗透模型的不断完善，这一宝贵的工具必将更好地助力外用复杂制剂的快速发展。药明康德DMPK已经成功的搭建了IVPT测试平台，已帮助客户完成了超过40个外用制剂的筛选，助力客户进行了仿制药申报（NMPA）研究。

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作者：徐椿云，董轩，汤城

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟