在CYP酶诱导实验中，如何获得更准确的EC50和Emax值？

随着研发领域对在研药物的CYP酶诱导风险评估的重视，越来越多的研发者希望在实验中获得对应的诱导参数EC₅₀, E_max值以进行后续的诱导风险的准确评估。为了得到准确的EC₅₀, E_max值用于评估在研药物的诱导风险，我们有以下建议：

（1）与常规的诱导实验设计一致，在溶解度允许和原代肝细胞毒性耐受的情况下，EC₅₀, E_max值测定实验需要设置5-8个浓度点，以8个浓度点为最优设计，且应包括比在研药物稳态最大游离血浆浓度（I_{max, u}）高一个数量级的浓度。

（2）需要根据前期诱导实验的结果进行测试浓度点等的实验设计，以尽可能获得完整的浓度-诱导效应曲线，即曲线呈S型。

（3）针对在研药物不同的诱导特性，选择最合适的方程拟合模型以获得较为准确的临床诱导风险计算。

药物相互作用（drug-drug interaction, DDI）主要是指病人同时或在一定时间内先后服用两种或两种以上药物后所产生的药物反应。药物相互作用中又以药物代谢酶介导的相互作用研究较为透彻，其中对CYP450酶的诱导可以造成其对应底物的代谢速率变化，引起底物在体内药代动力学的改变，即认为该底物与该诱导剂产生药物相互作用^[1]。而采用体外数据进行在研药物对代谢酶的潜在诱导作用的预测评估中，参数EC₅₀（半数效应浓度）和E_max（最大诱导效应）^[2-3]值的获得变得尤为重要。本文将详细讲述在体外诱导实验中如何进行实验设计，如何计算可以帮助提高诱导参数拟合计算的准确度。

1. 浓度范围和浓度点个数的设计：

在溶解度允许和细胞耐受的情况下，给药范围应包括在研药物稳态最大游离血浆浓度（I_{max, u}）高一个数量级的浓度在内的5-8个浓度点。

指导原则要求诱导实验中在研药物浓度范围应涵盖临床治疗的暴露范围，即在溶解度允许的情况下，该药物浓度范围应包括至少一个比体内最大的非结合稳态血药浓度高一个数量级的浓度^[2-3]。对于EC₅₀, E_max值测定实验，推荐的给药范围应包含：低诱导倍数浓度（通常为不产生诱导作用的浓度）、比体内最大的非结合稳态血药浓度高一个数量级的浓度（以防个体间的代谢差异性或与在研药物代谢酶的抑制剂联合治疗）和产生最大诱导反应的高浓度。该实验中在研药物的测试浓度较高，因而建议在正式诱导实验之前进行细胞毒性预试验，否则最高浓度下可能因为产生细胞毒性而导致数据缺乏意义^[4]。

此外，作为EC₅₀, E_max值测定实验需要设置5-8个浓度点，以8个浓度点为最优设计。从理论上讲，由于 logistic模型有四个参数，四个浓度实测值足以描述一条曲线，然而数值在曲线上的位置对于计算EC₅₀的准确性有很大影响，当曲线的下平台和上平台均至少有两个实验浓度数据时，才能得到准确的EC₅₀值^[5]。图1展示了不同浓度点个数及范围的拟合曲线，当选用8个浓度点（图1A）和选用5个浓度且包含两个平台期（图1B）时，拟合得到的E_max值小于实际观测到的E_max值的130%，且两种条件下拟合的EC₅₀值接近；当测试范围内诱导水平未达到平台期时（图1C），拟合得到的E_max值大于实际观测到的E_max值的130%，EC₅₀值也发生右移。

图1. 不同浓度点个数及范围的拟合曲线

2. 利用前期诱导结果辅助实验设计：

EC₅₀, E_max值测定实验需要前期诱导结果进行辅助设计，以尽可能获得完整的浓度-诱导效应曲线。

如上述第一点所述，特别是选用5个浓度点设计时，若不能选择到对应的诱导平台期，则可能使得计算得到的EC₅₀, E_max值准确性有所降低，因而有预实验辅助设计则浓度点选择上更有针对性，准确性进一步提升。

此外，在诱导实验中并不是浓度越高诱导倍数越高，高浓度可能因为存在细胞毒性而使得诱导倍数有所下调；即使在待测化合物未产生细胞毒性的情况下，诱导倍数在高浓度下仍可能下降^[6]。如图2所示，可以检测到诱导反应在低和中等浓度下浓度依赖性增加至平台期，在高浓度下可以检测到诱导反应的明显下降。图2展示了一个诱导反应的预测模型，如果没有前期预实验来指导设计从而未包括浓度4和5，就会错过诱导反应^[7]。

图2. 利用多个浓度点构建诱导反应的预测模型

3. 选择合适的回归模型进行拟合计算：

即使在有预实验指导的情况下依旧会有不理想的曲线呈现，那么选择合适的拟合曲线以得到准确的EC₅₀, E_max值进行临床诱导风险评估就变得尤为重要。

通常使用计算软件模拟都可以产生EC₅₀, E_max 的数值，但不同的模型可能导致值的准确性不同。以下分两种情况分别进行推荐：

对于结果呈现经典S形动力学的浓度-诱导效应曲线（以图3A，利福平的诱导曲线为例），表1中五个非线性回归模型计算的E_max和EC₅₀值相近，这种一致性表明，对于经典曲线拟合方式的选择上没有太大的差别，都可以进行相应的计算^[8]。

图3. 当达到或未达到平台期时五个非线性回归模型的比较

表1. 当观测到经典S形曲线时五个非线性回归模型的比较

对于非经典S形的浓度-诱导效应曲线（以图3B，依法韦伦的诱导曲线为例），需要使用合适的方法以提高诱导参数估算的可靠性。对于“钟形”曲线（如图3.B中圆点所示），建议使用Sigmoidal三参拟合或将Logistic三或四参拟合（表2），同时设定最大诱导倍数实测值来获得保守的DDI风险评估^[8]。

表2. 当观测到非经典S形曲线时五个非线性回归模型的比较

综上所述，对于部分需要更加精确预测的化合物，需要进一步的优化实验设计并根据数据选择合适的拟合模型进行计算，从而更加准确的预测临床的诱导风险。

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作者：仇佩缘，姜利芳，陈根富

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟，张莹莹