醛氧化酶在药物代谢中的早期预测及应对策略解析

醛氧化酶（aldehyde oxidase简称AOX）是一类含钼的黄素蛋白酶，属于药物代谢酶中的I相代谢酶。由于传统药物大部分是由CYP450代谢，药物化学家们设计新化合物时为了减少化合物被CYP450代谢提高其稳定性，经常加入含氮芳香杂环的结构，这一改变却有可能导致化合物被AOX代谢。在过去的十几年里，随着研发新药中AOX潜在底物比例的上升，和早期忽视AOX代谢导致的新药临床试验失败报道的增多，AOX在制药行业的关注度逐渐上升。因为AOX有显著的种属性差异，目前仍然没有最合适的模拟人体内代谢的临床前动物模型，通过IVIVE的方式去预测化合物在人体内被AOX代谢的结果准确性不高。如果能够在药物研发早期预测化合物是否被AOX代谢，通过合理的结构优化避免或者降低AOX代谢的速率，能大大减少药物在研发后期临床阶段面临的麻烦。本文将针对AOX在药物代谢中的作用和重要性，底物的分类、识别和鉴定，以及研发中遇到AOX代谢的应对策略进行一个概述，为新药研发中提高药物成药性提供思路。

一、AOX在药物代谢中的作用和重要性

Pryde等人的研究表明，虽然在drug bank罗列的小分子上市药物中可能是AOX的底物只占了13%，但在收录了研发中新药的Prous Integrity数据库中，这一比例上升到了45%，远高于上市药物的比例^[1]。甚至在一些特定的药物类型中（例如以激酶为靶向的药），药物是AOX的潜在底物的比例更是高达56%^[1]。除了传统的小分子药物，现在有研究表明PROTAC分子也可能被AOX代谢^[2]。

图1. 不同数据库中推测为AOX潜在底物的化合物比例^[1]

由于目前市面上大于50%的药物仍然主要由CYP450代谢，一般药物在临床前的研究会更注重CYP450的代谢和表型鉴定。药物常规筛选时做的针对CYP450酶的代谢研究有可能会导致对非CYP酶尤其是AOX参与代谢的忽略，体现在孵育体系的选择和实验条件的不同上。CYP450存在于肝微粒体，AOX存在于细胞浆中；CYP450需要NADPH作为辅酶，AOX的催化反应则不需要添加额外的辅酶。

AOX还有着明显的种属差异性，在人体内有且仅有一种有活性的AOX1亚型，主要分布在肝，肾脏及肠道系统中。在常用的临床前动物模型中，大小鼠的肝内同时存在AOX1和AOX3两种亚型，食蟹猴和豚鼠肝内只有AOX1一种亚型。值得注意的是，犬肝内不表达任何AOX基因（即没有AOX酶的代谢），其他组织内也没有和人同源的AOX1亚型^[3]，唯二表达的AOX4和AOX2亚型集中存在于泪腺和鼻黏膜处。对于被AOX代谢的药物，如果体内实验选择了不合适的动物模型，比如犬，有很大的概率忽视其被AOX代谢的可能性。

图2. AOX在人和常用的临床前动物模型中的亚型表达^[3]

当进行代谢研究时忽略了AOX，这样的药物进入到后期的临床试验时，往往会面临一系列无法预测的风险。例如药物被AOX快速清除导致的生物利用度过低，AOX的代谢产物有毒性，AOX代谢产物有可能会产生药物间相互作用，或者人体和动物体内代谢产物比例的不一致需要补充安全性测试等等^[4]。所以如果能够尽早识别药物是否能被AOX代谢，将减少其在研发后期面临的困难。

图3. 药物研发中由于AOX参与代谢带来的挑战和困难^[4]

二、AOX的底物类型及结构特征

AOX的底物非常广泛，主要催化的反应有三种：氧化，还原和水解反应。

2.1 氧化反应

在氧化反应中，AOX可以将醛氧化成相应的羧酸（醛氧化酶因此而得名）。虽然在常见的药物结构中很少出现醛官能团，但醛常常产生于其他药物代谢酶如CYP450或者单胺氧化酶的中间代谢产物中。

除此之外，芳香族的含氮杂环是最常见同时也是最受重视的被AOX氧化的底物类型，因为它通常被用作药物开发和设计过程中的结构支架。氧化反应的位点大多数在邻氮的杂化碳上，但是也有个别例子是发生在远处的碳上（喹啉和吡嗪等）。一些特性会使得化合物更容易被AOX氧化，比如氮的数量，杂环含氮越多被氧化的可能性越大，嘧啶氧化比吡啶氧化更常见；其次是含氮芳香杂环的大小，在单杂环情况下，六元环比五元环更容易被AOX氧化；第三是环内的电子基团类型，一般情况下吸电子基团和给电子基团能分别增加和降低化合物被AOX催化的可能性，但是一些给电子基团也能够促进化合物与AOX酶结合，反而增加了可能性。经Manevski总结，含有嘧啶，喹啉和嘌呤三种结构的化合物是AOX底物的可能性很高，在对这类化合物的药物代谢研究中应当优先考虑到其被AOX代谢的潜在情况^[4]。

2.2 还原反应

AOX可以催化硝基化合物，氮氧化物，亚砜，异恶唑，异噻唑，亚硝酸盐和羟肟酸的还原反应。其中硝基化合物的还原反应会形成羟胺和伯胺，在经过生物活化以后有可能带来一系列的药物不良反应。比如尼美舒利被AOX酶还原后，能进一步被CYP酶氧化和GSH结合，产生肝毒性。

2.3 水解反应

GDC-0834（一款BTK抑制剂候选化合物）的临床失败案例首次揭示了AOX能催化化合物的水解反应。通过对AOX催化酰胺水解的SAR研究，推断经AOX催化的水解反应不是孤例，而且芳香族酰胺更容易被AOX水解。

三、AOX代谢的识别与鉴定

对AOX酶底物的分类和常见结构的总结，能帮助我们基于化合物的结构初步判断和预测化合物是否会被AOX代谢，同时我们也应当关注特定体外实验中不一致的结果和动物PK实验结果中的种属性差异（图4），三者结合在一起能够帮助我们确定是否是AOX参与了药物代谢。

体外实验主要是指化合物在肝微粒体和肝细胞里的稳定性测试，如果在肝细胞里的消除速率远高于在肝微粒体里的消除速率，或者在不添加NADPH辅酶孵育的肝微粒体里化合物仍然被代谢，应当怀疑是否有非CYP酶（包含AOX酶）参与了代谢。

由于AOX有很显著的种属差异性，在不同动物中的亚型种类和活性有差异，通过比较不同临床前动物体内实验的结果（代谢产物鉴定）也能帮助我们判断AOX是否可能参与了代谢。例如AOX1亚型在犬体内是缺失的，如果化合物的某一个代谢产物在其他动物（大小鼠或者猴）体内被检测到，唯独在犬体内是缺少的，应当考虑这个化合物被AOX代谢的可能性。

进一步验证化合物是否被AOX代谢，可以选择肝S9（不添加辅酶）或者肝细胞浆体系进行孵育。通过比较加入AOX抑制剂和不加抑制剂情况下化合物的代谢速率可以鉴定AOX是否参与了代谢，常用的抑制剂有选择性强的肼屈嗪和抑制能力强的雷洛昔芬，或者也可以通过AOX重组酶的孵育直接观测是否有氧化产物的生成。

图4. 药物被AOX代谢的识别及验证流程图^[5]

四、药物研发中涉及AOX代谢的应对策略

鉴于AOX参与代谢的新药候选化合物经常会在临床试验中表现出快速清除，生物利用度过低，引发毒性问题和MIST的问题，目前药物化学界主流的策略仍然是通过对化合物结构的调整来最大可能地减少AOX的代谢占比。那么如何判断在何种情况下需要重视AOX代谢对药物进行优化呢？

Deepak等人提出了一个初步的决策树（图5）^[5]：

1. 在化合物被包含AOX的多种代谢酶代谢的情况下，需要进行酶表型鉴定来判断AOX的代谢占比，如果AOX不是主要的代谢酶，可以继续推进研发。

2. 在AOX是化合物唯一或者最主要的代谢酶的情况下，应该考虑替换掉化学结构中的AOX代谢位点。如果受影响的代谢位点是一个不能被取代的药效基团，可以先参照Zientek等人的半定量对标已知AOX底物的衡量方法^[6]，将化合物划分成能被AOX代谢的低、中、高清除类型。

• 对于中高清除层级的化合物来说，仍然需要考虑修改它的化合物结构来终止AOX的代谢或者降低代谢速率；

• 低清除层级的化合物则可以采取降低AOX代谢速率的方法或者继续推进研发。

图5. 减少AOX参与新药代谢带来风险的决策树^[5]

那么，如何对药物结构调整来达到终止AOX代谢或者降低AOX代谢速率的目的呢？有研究通过总结成功的例子表明可以从以下几个方面进行结构修改（图6）^[4]。

4.1 终止AOX代谢

1. 封闭氧化位点

通过引入甲氧基，二氟甲基和氟原子等取代，对易被AOX氧化代谢的位点进行封闭。氨基的引入也有成功的例子，但是引入后的芳基胺结构会增加药物不良反应的风险，应该谨慎选用。

2. 将被氧化的碳原子替换成杂原子

吡啶→哒嗪，异喹啉→噌啉是两个成功的例子，但是新的杂原子的加入也有可能导致AOX代谢位点发生迁移而不是终止其代谢。

3. 移除苯环或杂环内的氮原子

不含氮的杂环几乎不会成为AOX的底物，这种改变方式能有效地终止AOX代谢，但是会增加化合物的亲脂性，导致其被CYP450代谢的可能性增加。

4. 改变环的大小

AOX的氧化大多发生在六元环，单环结构中，将六元环改成五元环可以终止AOX的代谢。稠环的情况比较复杂，AOX的氧化可以在两个六元环稠并的多环或者一个五元环一个六元环稠并的多环中发生，但几乎不会出现在两个五元环稠并的多环里。

5. 芳香族杂环的饱和

将芳香族杂环变成脂肪族杂环通常可以终止AOX的代谢，但是如果脂肪族杂环能够被CYP450代谢后生成亚胺离子，AOX仍然可以继续氧化亚胺离子。

4.2 降低AOX代谢速率

1. 调整含氮杂环的电子属性

通过重新排列环内杂原子或者取代基团的位置、引入新的吸电子基团或者给电子基团，但并不直接封闭代谢位点的方式来降低代谢反应速率。

2. 增加代谢位点的位阻

在被氧化的位点附近引入更大的取代基，增加代谢位点的空间位阻，降低AOX的代谢速率。

3. 引入氘的动力学同位素效应

氘是氢的同位素，因为C-D键远比C-H键更难断裂，而C-H键的断裂是AOX氧化反应里的限速步骤，所以利用氘的同位素效应可以减弱AOX的代谢。

4. 改变远端的取代基来减弱与AOX酶的结合

改变位于代谢位点远端的取代基来干扰化合物和AOX酶的结合或者和钼蝶呤辅酶的相互作用。

图6. 药物研发中应对AOX代谢的不同方法^[4]

 除了极力避免AOX代谢的策略以外，我们还可以从另一个角度来助力药物研发的推进——利用AOX的快速代谢。如果AOX的代谢产物保留了理想的药效，则或许可以使用前药设计的策略来将原化合物的劣势转化为优势。图7给出了一个通过AOX代谢的前药例子，泛昔洛韦能很快被吸收并被酯酶和AOX代谢，转化成的有活性的喷昔洛韦却很稳定，生物利用度很高。

图7. 作为AOX底物应用前药修饰策略的代表性药物^[4]

药明康德DMPK有完善的药物代谢酶表型鉴定平台，通过化学抑制法和重组AOX酶孵育法，结合对代谢产物的鉴定结果，可以判断AOX是否参与药物代谢并且识别代谢位点，为化合物的结构优化修饰提供依据。

结语  

过去几十年间忽视AOX参与代谢导致药物临床试验失败的众多例子，一度让研发中谈AOX色变，同时它还有很显著的种属差异性，使得选择合适的能模拟人体内情况的动物模型更加困难，但是所有失败或成功的例子都为我们总结AOX的代谢预测和应对策略提供了经验。在药物筛选中，建议通过早期对药物结构的判断，对肝微粒体、肝细胞实验和动物实验中出现的异常结论引入是否有AOX参与代谢的考量，进行识别和验证。即使确定了药物被AOX代谢，也可以通过调整药物结构，前药策略等一系列的方法有针对性地终止、降低甚至是利用AOX的代谢来助力药物研发的继续推进。

药明康德DMPK依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1500家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1200个新药临床研究申请（IND）。 

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作者：陈诗妍，李瑞兴，金晶

编辑：方健，钱卉娟

设计：倪德伟